杉木人工林土壤質量演變過程中土壤微生物群落結構變化

劉 麗，徐明愷，汪思龍，2，張倩茹，王 楠，潘華奇，胡江春，*

(1.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所/森林與土壤生態(tài)國家重點實驗室，沈陽 110016;2.中國科學院會同森林生態(tài)實驗站，湖南 418307;3.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所，沈陽 110016)

杉木Cunninghamia Lanceolata是我國亞熱帶主要的造林樹種，在我國南方林業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。近幾十年來，杉木人工林取代自然林并不斷連栽引起的土壤質量惡化，生產(chǎn)力下降等問題凸顯，嚴重制約了杉木人工林可持續(xù)發(fā)展［1-3］。針對杉木純林和連栽帶來的種種弊端，我國學者提出通過混交和輪栽等經(jīng)營模式來緩解杉木純林和連栽造成的土壤質量退化，達到恢復土壤肥力，提高杉木人工林可持續(xù)生產(chǎn)力的目的［4］。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分部分，幾乎所有的土壤過程都直接或間接的與土壤微生物有關［5］。許多學者認為森林土壤微生物及其生態(tài)功能變化是土壤質量演變的關鍵過程，并圍繞土壤微生物和功能群開展了大量的研究［6-7］。在我國南方，隨著天然闊葉林被人工林所取代，加上人工林經(jīng)營管理措施(混交林模式)的影響，土壤微生物群落結構、種群多樣性及功能群會隨土壤質量發(fā)生改變，進而可以反映出一個生態(tài)系統(tǒng)土壤質量受損程度或恢復潛力。在評價人工林經(jīng)營管理措施時，及時有效的監(jiān)測土壤微生物及功能群變化，可為實現(xiàn)退化土壤生態(tài)系統(tǒng)恢復和人工林可持續(xù)經(jīng)營提供理論依據(jù)，對揭示人工林經(jīng)營引起土壤質量演變的微生物學機理具有重要意義。

當前，隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，許多方法和理念被應用到土壤微生物生態(tài)學研究中，并因此而逐漸形成了一個新的研究方向——土壤微生物分子生態(tài)學［8］，極大的豐富了人們對土壤生態(tài)系統(tǒng)中不可培養(yǎng)微生物及其群落的認識［9］。我國有關土壤微生物與杉木人工林土壤質量變化的研究，主要局限于采用傳統(tǒng)方法研究土壤微生物數(shù)量、生化作用等方面［10-11］。然而，不同人工林經(jīng)營模式(連栽和混交)引起的杉木人工林土壤質量變化對土壤微生物(細菌和真菌)的群落結構和多樣性產(chǎn)生怎樣的影響?有哪些關鍵種群發(fā)生變化?微生物群落結構，多樣性和關鍵種群變化與杉木人工林土壤退化/恢復之間有怎樣的關系?針對這些問題，傳統(tǒng)微生物學方法已遠遠不能解決。因此，嘗試從分子水平來解釋這些科學問題是本研究的目的，同時旨在揭示人工林經(jīng)營導致土壤質量演變的微生物分子生態(tài)學機理。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣地概況

研究地位于湖南省會同縣中國科學院會同森林生態(tài)實驗站(109°36'E，26°51'N)，海拔200—500 m，為低山丘陵地貌，屬亞熱帶濕潤氣候，年均氣溫16.5℃，年均降雨量約1200 mm，年均相對濕度80%，土壤為紅黃壤，由板頁巖發(fā)育而成，土層厚度約50 cm。地帶性植被類型為典型的亞熱帶常綠闊葉林，組成樹種多以栲樹(Castanopsis spp.)和石櫟(Lithocarpus spp.)為主。但是，由于人為活動的影響，原有地帶性森林植被破壞嚴重，而代之以杉木(C．lanceolata)為主的人工林和馬尾松(Pinus massoniana)為主的或以馬尾松和白櫟(Quercus fabri)、楓香(Liquedabar formosana)等為主的次生常綠針葉、闊葉混交林。

研究樣地分為兩組，一組為杉木連栽林試驗地，另外一組為杉木混交林試驗地。每一組試驗地的坡度、坡向和海拔等立地條件一致。第1組試驗地包括:常綠闊葉林(NF，native forest)，平均林齡為41a，到2007年4月為止面積為10 hm2;杉木一代林(FCF，first-generation C．lanceolata plantation)，1983年春在部分NF皆伐地上營造;杉木二代林(SCF，second-generation C．lanceolata plantation)，1983年春在21年生杉木一代林皆伐地上營造;杉木三代林(TCF，third-generation C．lanceolata plantation)，1983年春在21年生杉木二代林皆伐地上營造。3種杉木純林種植密度2000株/hm2，每種林份面積達到3 hm2。第2組試驗地營造于1990年，1989年秋杉木一代林皆伐后營造的杉木二代林(CF，C．lanceolata plantation)、杉木火力楠混交林(CFM，C．lanceolata-Michelia macclurei mixed plantation)、杉木榿木混交林(CFA，C．lanceolata-Alnus cremastogyne mixed plantation)和杉木刺楸混交林(CFK，C．lanceolata-kalopanax septemlobus mixed plantation)，每種林份面積達到3 hm2。3種混交林中，杉木與闊葉樹的比例為8∶2，其中杉木的種植密度約為1296株/hm2，闊葉樹的種植密度為324株/hm2。CF種植密度為1620株/hm2。

1.2 樣品采集與處理

2007年4月在上述8個森林類型中按照坡面由左至右分別設置3個樣方(10 m×10 m)，在每個樣方內設4個采樣點，除去表層凋落物后采集0—10 cm土壤，混合，去除植物殘體和石子，過2 mm土壤篩，均勻分成3份，一份置于4℃冰箱冷藏，另一份置于-20℃冰箱冷凍，供土壤微生物DGGE分析實驗;第3份置室內自然風干、磨碎、過100目孔徑篩，用于土壤理化性質分析。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤化學性質的測定

土壤pH測定，將風干供試土樣制成土∶水為1∶2的混合液，靜置30 min，然后用酸度計測定。土壤總有機碳和全氮測定，將風干供試土樣過100目土壤篩，準確稱取1.0000 g土樣，土壤總有機碳和全氮采用元素分析儀vario EL III(Elementar，Germany)直接測定。土壤可溶性有機碳測定采用文獻［12］的方法測定，供試土壤冷水浸提有機碳。土壤速效養(yǎng)分測定，土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、速效磷和速效鉀的測定參照文獻［13］。

1.3.2 土壤微生物總DNA提取與純化

土壤細菌總DNA提取參照文獻［14］。土壤真菌總DNA提取參照文獻［15］。粗DNA采用DNA膠純化試劑盒Kit Ver.2.0(TaKaRa)進行純化，純化方法參照操作說明進行。

1.3.3 PCR-DGGE

以不同土壤樣品的總DNA為模板，土壤細菌16SrDNA特異片段用細菌通用引物GC+341f-907r［16］進行PCR擴增。土壤真菌28S rDNA特異片段采用通用引物GC+U1-U2［17］進行擴增。PCR和DGGE條件采用文獻［18］。

1.3.4 特征條帶測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

DGGE特征條帶在無菌操作下用刀片切下，放入 EP管中，加入30μL TE(10 mmol/L Tris-HCl;1 mmol/LEDTA，pH值8.0)，4℃過夜處理。待膠中DNA溶出后，取3μL作為模板，再次進行PCR擴增，并用DGGE確認擴增結果與切膠遷移位置是否一致。確認一致后，以不帶GC夾的引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物使用試劑盒純化，委托上海生工生物工程技術有限公司測序。將所得序列登錄GenBank。應用GenBank提供的Blast進行同源性比較，并將最鄰近的序列保存為FASTA格式。利用Clustal軟件進行多序列比對并生成ALN格式文件，利用MEGA4.0軟件包中的Seqboot軟件進行分析，并應用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定所測序列微生物克隆的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.4 計算和統(tǒng)計方法

運用主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)綜合評價不同杉木人工林生態(tài)系統(tǒng)土壤肥力質量現(xiàn)狀，確定不同杉木人工林土壤質量的變化趨勢。運用圖像分析軟件Quantity One(4.6.2)分析DGGE圖譜。利用DGGE圖譜的數(shù)字化結果計算土壤樣品微生物群落的Shannon-Wiener指數(shù)(H')、豐富度(S)和均勻度(EH)，以此來評價土壤微生物群落結構多樣性的變化。數(shù)據(jù)的方差分析、標準誤差和相關性分析均采用SPSS 13.0軟件進行，作圖采用ORIGIN 6.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 杉木人工林土壤質量變化主成分分析

表1中顯示不同杉木人工林土壤養(yǎng)分、pH值和C/N比的變化。鑒于單一分析各個指標難以明確各杉木人工林土壤質量的變化，因此采用PCA方法分析土壤質量的變化趨勢。

表1 不同杉木人工林土壤性質變化Table 1 Soil properties of the different plantations

運用PCA方法綜合分析土壤養(yǎng)分變化，以各主成分特征貢獻率為權重，加權計算各林地土壤質量綜合主成分值(表2)。主成分值是數(shù)值經(jīng)過標準化后計算的結果，正負不表示實際意義，只表示相對大小。土壤質量綜合主成分數(shù)值顯示，杉木人工林取代自然林導致土壤質量明顯降低，并且連栽的造林模式亦導致土壤質量下降，土壤質量變化趨勢為:自然林＞杉木一代林＞杉木二代林＞杉木三代林，可見長期單一種植杉木人工林會引起土壤質量衰退(表2，圖1)。杉木火力楠混交林土壤質量綜合主成分值顯著高于杉木純林及其他兩種杉闊混交林，說明杉木與火力楠混交后使土壤質量明顯改善;杉木與榿木混交后土壤綜合主成分值雖然有所增加，但是卻不顯著，杉木與刺楸混交后土壤綜合主成分值不但沒有增加，卻顯著下降，可見杉木與榿木、刺楸混交并未達到改善杉木人工林土壤質量的目的(表2，圖1)。

表2 不同杉木人工林土壤質量主成分數(shù)值Table 2 The values of the principal components associated with PCA of soil fertility in different plantations

通過主成分分析，將多維的土壤養(yǎng)分變量降維成兩個變量進行分析，即第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)，其中PC1貢獻率達到54.49%，PC2貢獻率達到23.22%，二者累計貢獻率達到77.71%，因此這兩個主成分就能夠解釋原始變量。表3中列出初始因子在PC1和PC2上的負荷矩陣，其中土壤pH值和碳氮比在第二主成分上有較高的負荷，說明PC2主要表示這兩個初始變量的信息;其它初始因子在第一主成分上有較高負荷，說明第一主成分表示了除土壤pH值和碳氮比以外的土壤性質的信息。根據(jù)PC1和PC2的標準化數(shù)值作圖(圖1)，可以綜合直觀的分析不同杉木人工林土壤質量變化趨勢，避免了采用單純分析某一土壤理化性質改變而確定森林土壤質量變化趨勢的弊端。

表3 主成分分析因子負荷矩陣Table 3 Component matrix of PCA

由圖1可知，NF、FCF、SCF、TCF在PC1和PC2上逐漸分離，并且在PC1上的分離較大，說明隨著連栽代數(shù)的增加杉木人工林土壤質量與自然林之間的差距拉大;FCF、SCF在圖中未分離，說明杉木一、二代林土壤質量相似;TCF與FCF、TCF明顯分離，可見連栽杉木人工林在多代連栽的情況下土壤質量改變較大，這與綜合主成分值分析的土壤質量變化趨勢結果相一致。

CFM、CFA、CF和CFK在PC1上逐漸分離，在PC2上分離較小，說明這幾種土壤pH值和碳氮比變化較小，而其它養(yǎng)分因子變化較劇烈;CF與CFA在PC1上分離很小，而與其它兩種混交林分離較明顯，這與表2中的綜合主成分值分析相一致，說明杉木榿木混交后土壤質量變化不明顯?？梢娫诓捎没旖荒Ｊ竭M行林地土壤質量恢復過程中，杉木與火力楠混交能夠明顯改善土壤質量。

2.2 土壤細菌群落DGGE分析

應用本實驗中的總DNA提取方案，得到供試土壤細菌總DNA片段約20 kb，純化并稀釋后做為模板，采用細菌通用引物GC+341F-907R［16］對16SrRNA基因的V3—V8區(qū)進行PCR擴增，得到566 bp片段。此處圖省略。

根據(jù)PCR產(chǎn)物在DGGE指紋圖譜上的條帶數(shù)目和遷移的距離，16SrDNA序列的PCR擴增與DGGE的結合運用能夠從DNA水平區(qū)別不同微生物群落結構之間的差異。從圖2中可以看出，某些條帶為不同杉木人工林土壤所特有;隨著杉木人工林取代自然林并不斷連載，B5條帶逐漸消失，B6、B7逐漸顯現(xiàn);而B6、B7條帶隨著杉木與闊葉樹混交又逐漸減弱，而原來消失的B5條帶逐漸恢復，伴隨著B1、B3條帶的逐漸增強，這說明隨著杉木林生態(tài)系統(tǒng)的變化，土壤細菌群落結構組成產(chǎn)生了相應改變。利用DGGE圖譜的數(shù)字化結果計算土壤樣品細菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)(H)、豐富度(S)和均勻度(EH)，結果見圖3。杉木人工林取代自然林后，隨著連栽代數(shù)的增加，土壤細菌多樣性和豐富度不斷降低(P＜0.05)。杉木與火力楠、榿木混交后細菌多樣性和豐富度較杉木純林顯著提高(P＜0.05)，而杉木與刺楸混交則造成進一步降低(P＜0.05)，說明土壤細菌群落結構會隨混交闊葉樹種的不同而發(fā)生變化。

圖1 不同杉木人工林土壤質量主成分分析點圖Fig．1 Principal component(PC1 × PC2)plots generated from covariance matrix of soil physicochemical characteristics of the different plantations NF:常綠闊葉林Native forest;FCF:杉木一代人工林First-generation C．lanceolata plantation;SCF:杉木二代人工林Second-generation C．lanceolata plantation;TCF:杉木三代人工林 Third-generation C．lanceolata plantation;CF:杉木人工林C．lanceolata plantation;CFM:杉木火力楠混交林 C．lanceolata-M．macclurei mixed plantation;CFA:杉木榿木混交林 C．lanceolata-A．cremastogyne mixed plantation;CFK:杉木刺秋混交林 C．lanceolata-K．septemlobus mixed plantation

圖2 土壤細菌16Sr DNA特異片段PCR-DGGE指紋圖譜Fig．2 DGGE community fingerprints of 16S r DNA fragment from soil bacteria DNA extracted from soil samples under different plantations

圖4 b顯示杉木純林和杉木混交林土壤細菌群落的變化，CF分別與CFM、CFA在第一主成分PC1(貢獻率為48.52%)、第二主成分PC2(貢獻率為33.70%)上分離，而與CFK在PC1和PC2上分離度都很小，位于同一象限內，說明杉木純林和杉木刺楸混交林土壤細菌群落結構差異較小，與其他兩種混交林差異較大。

如前所述，細菌DGGE圖譜條帶進行主成分分析，PC1主要表示條帶強度大于150的條帶信息，將DGGE圖譜中這些主要特征條帶中的7條切下(B1—B7)，經(jīng)驗證后測序，將所得序列登錄GenBank，獲得登錄號為GQ423440—GQ423446。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，結果顯示湖南會同地區(qū)杉木人工林土壤中細菌的優(yōu)勢種群為αproteobacteria、β-proteobacteria、γ-proteobacteria 和 CFB類群(圖5)。

從不同杉木人工林土壤細菌DGGE圖譜可看出，當杉木人工林取代自然林后，土壤細菌群落結構受到影響:親緣關系與 Sphingobacterium sp.、Pedobacter sp.、Burkholderia sp.和Lueifibra arvensicola密切的細菌種群減少;親緣關系與Pedobacter cryoconitis密切的細菌種群受擾動較大，在杉木人工林土壤中消失;在杉木一、二和三代林土壤中均出現(xiàn)了親緣關系與Rhodanobacter sp.密切的細菌種群;在連栽杉木三代林土壤中細菌群落改變最大，除與杉木一、二代林變化相同外，還出現(xiàn)了親緣關系與Xanthomonas sp.密切的細菌種群(圖2a，圖5)。

杉木與闊葉樹混交后，土壤細菌群落結構也發(fā)生改變:與杉木純林土壤細菌群落相比，杉木火力楠混交林和杉木榿木混交林土壤細菌群落多樣性和豐度有所提高，與 Burkholderia sp.、Luteifibra arvensicola、Sphingobacterium sp．和Pedobacter cryoconitis親緣關系密切的細菌種群增加;杉木與刺秋混交后，土壤細菌群落多樣性和豐度沒有改善，與Sphingobacterium sp.、Pedobacter sp.、Burkholderia sp.和Luteifibra arvensicola親緣關系密切的細菌群落消失(圖2b，圖5)。

圖3 不同杉木人工林土壤細菌群落基因多樣性指數(shù)Fig．3 Genetic diversity indices of microbial communities in different plantations

圖4 不同杉木人工林土壤細菌DGGE指紋圖譜主成分分析Fig．4 Principal component(PC1×PC2)plots generated from covariance matrix of B－DGGE bands obtained from soil samples under different plantations

圖5 土壤細菌DGGE指紋圖譜16S r DNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．5 Phylogenetic tree of all sequences of 16S r DNA from B-DGGE bands

圖6 土壤真菌28S r DNA特異片段PCR-DGGE指紋圖譜Fig．6 DGGE community fingerprints of 28S r DNA fragment from soil fungi DNA extracted from soil samples under different plantations

2.3 土壤真菌群落DGGE分析

采用真菌通用引物GC+U1-U2［17］對28SrRNA基因部分片段進行PCR擴增，得到260 bp片段。此處圖省略。

圖6顯示不同杉木人工林土壤真菌特異性PCR-DGGE圖譜，隨著杉木人工林取代自然林并不斷連栽，土壤真菌群落結構的變化較明顯，尤其是NF與TCF土壤真菌DGGE圖譜特征條帶的變化;杉木與闊葉樹混交后土壤真菌特征條帶也發(fā)生改變，在CFM圖譜中出現(xiàn)條帶F1，在CFA、CFK圖譜中出現(xiàn)了條帶F7，推測這兩個條帶所代表的真菌類群可能是導致土壤質量變化的主要類群，還需要進一步驗證。

圖7結果顯示，杉木人工林取代自然林后土壤真菌多樣性和豐富度有所提高，但FCF、SCF與NF之間土壤真菌多樣性指數(shù)變化差異沒有達到顯著性(P＞0.05)，只有TCF與NF之間達到顯著性差異(P＜0.05)。隨著杉木不斷連栽土壤真菌多樣性和豐富度呈現(xiàn)提高的趨勢，杉木二代林與杉木一、三代林之間差異不顯著(P＞0.05)，杉木一代林與杉木三代林之間差異顯著(P＜0.05)，說明隨著杉木不斷的連栽土壤真菌群落多樣性和豐度提高的幅度也不斷增加。杉木與3種闊葉樹混交后土壤真菌多樣性和豐富度較杉木純林顯著降低(P＜0.05)，而3種混交林之間土壤真菌多樣性和豐度變化不大(P＞0.05)?？梢姡蠒貐^(qū)杉木林土壤真菌多樣性和豐度的變化趨勢與土壤細菌是完全不同的。

圖8a顯示連栽杉木人工林土壤真菌群落結構的變化趨勢，NF與 FCF、SCF主要在 PC2(貢獻率為22.18%)顯著分離，在PC1(貢獻率為61.53%)分離度很小;NF與TCF在PC1和PC2上均明顯分離;FCF和SCF在PC1和PC2上的分離度都很小，而且都與TCF在PC1上明顯分離。由于PC1的貢獻率遠大于PC2，從不同杉木人工林土壤真菌DGGE圖譜主成分分析可以看出，NF與FCF、SCF土壤真菌群落結構變化差異較小，而其與TCF之間的變化差異較大，說明隨著杉木人工林的不斷連栽土壤真菌群落結構變化也加大，這一點與土壤細菌群落結構的變化趨勢相似。

圖7 不同杉木人工林土壤真菌群落基因多樣性指數(shù)Fig．7 Genetic diversity indices of microbial communities in different plantations

圖8 不同杉木人工林土壤真菌DGGE指紋圖譜主成分分析Fig．8 Principal component(PC1 × PC2)plots generated from covariance matrix of F-DGGE bands obtained from soil samples under different plantations

圖8b顯示杉木純林和杉木混交林土壤真菌群落的變化，CF分別與CFM、CFA、杉木CFK主要在PC1(貢獻率為58.16%)上分離，說明杉木純林與3種杉闊混交林土壤真菌群落結構組成相差很大;3種杉闊混交林主要在PC2(貢獻率為22.63%)上分離，在PC1上分離很小，表明3種杉闊混交林土壤真菌群落結構組成相似。

回家后的賽利亞審視自己未來的出路：一方面，她繼承了祖母留下的卡拉米洛披肩，看到了自己與他人、家庭、民族之間的聯(lián)系，這使得她理解了祖母和家人、接納了自己的民族身份；另一方面，她以一種更加理智、全面的方式重建自己的文化身份，文化身份不再是一個非此即彼的選擇，而是一個融合了多重文化的身份重建。

將土壤真菌DGGE圖譜中主要特征條帶中的10條切下(F1—F10)，條帶強度均大于100，經(jīng)驗證后測序，將所得序列登錄GenBank，獲得登錄號為GQ423447—GQ423456。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，結果顯示湖南會同地區(qū)杉木人工林土壤中真菌的優(yōu)勢種群主要是子囊菌和擔子菌亞門的種屬(圖9)。

圖9 土壤真菌DGGE指紋圖譜28S r DNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．9 Phylogenetic tree of all sequences of 28Sr DNA from F-DGGE bands

從不同杉木人工林土壤真菌DGGE圖譜中可以看出，當杉木人工林取代自然林后，土壤真菌群落結構受到影響:FCF、SCF與 NF之間土壤真菌群落結構變化不大，一部分種群有減少的趨勢，如親緣關系與Creosphaeria sassafras、Tubeufia paludosa、Serendipita vermifera密切的真菌種群，一部分種群有增加的趨勢，如親緣關系與Pyricularia longispora和Cladosporium cf．subtilissimum密切的微生物種群，但也有一些種群消失，如親緣關系與Pseudomassaria carolinesis和Sphaerobolus iowensis密切的微生物種群;土壤真菌群落結構在TCF與NF 之間變化較大，親緣關系與 Pseudomassaria carolinesis、Creosphaeria sassafras、Sphaerobolus iowensis、Pyricularia longispora和Cladosporium cf．subtilissimum密切的真菌種群消失，而親緣關系與Sclerotinia sp.、Mycosphaerella sp.和Marasmius graminum密切的真菌種群出現(xiàn)(圖6a，圖9)，可見連續(xù)單一種植杉木人工林會引起土壤真菌群落劇烈改變。

杉木與闊葉樹混交后，土壤真菌群落結構也發(fā)生改變:主要表現(xiàn)為某些種群的恢復，如與Creosphaeria sassafras和Sphaerobolus iowensis親緣關系密切的真菌種群出現(xiàn)，與Mycosphaerella sp.和Marasmius graminum親緣關系密切的真菌種群消失;大部分共有條帶亮度接近于自然林圖譜，說明真菌群落結構組成在杉闊混交林土壤中有逐漸接近自然林的趨勢(圖6b，圖9)。

2.4 杉木人工林土壤微生物群落結構變化與土壤質量的關系

表4結果顯示，土壤細菌多樣性指數(shù)變化與大部分土壤化學性質顯著相關，其中與全氮、可溶性碳、銨態(tài)氮、速效鉀和有效磷呈極顯著正相關(P＜0.01)，與土壤pH值和總有機碳呈顯著正相關(P＜0.05)，與土壤質量主成分值極顯著正相關(P＜0.01)。土壤細菌主成分分析PC1也與土壤質量和大部分土壤化學性質顯著正相關。

表4 杉木人工林土壤細菌群落結構變化與土壤化學性質的相關性分析Table 4 Pearson's correlation analyses between the bacterial community and soil properties from all sites

表5結果顯示，土壤真菌多樣性指數(shù)變化與大部分土壤化學性質均無顯著相關性(P＞0.05)，僅僅與土壤碳氮比呈顯著正相關，與土壤pH呈顯著負相關(P＜0.05)，這一點與細菌結果明顯不同。表示自然林和杉闊混交林的DGGE特征條帶以及幾種土壤中共有條帶的PC1也與大部分土壤性質無顯著相關性(P＞0.05);然而，表示杉木三代林的DGGE特征條帶的PC2與多數(shù)土壤性質顯著負相關(P＜0.05)，包括總有機碳、總有機氮、可溶性碳、銨態(tài)氮、速效磷以及土壤質量主成分值(PC1和PC)，可見PC2表示的條帶所代表的真菌種群可能是導致土壤質量變化的關鍵種群。

表5 杉木人工林土壤真菌群落結構變化與土壤化學性質的相關性分析Table 5 Pearson's correlation analyses between the fungal community and soil properties from all sites

3 討論

3.1 杉木人工林土壤質量變化過程中土壤細菌群落變化特征

基于細菌16SrDNA保守特點，DGGE指紋圖譜技術目前已經(jīng)廣泛的用于監(jiān)測細菌生長和分析細菌群落，本文運用該技術結合PCA分析，區(qū)別不同杉木林土壤細菌群落結構的變化，并采用多樣性指數(shù)(H，S和EH)評價不同土壤微生物群落多樣性，高的多樣性指數(shù)數(shù)值表明高的微生物群落多樣性［19］。本研究表明，連栽杉木人工林土壤細菌群落多樣性和豐度顯著低于自然林和杉闊混交林(除杉木刺楸混交林外)，并且隨著連栽代數(shù)的增加不斷降低。這與以前采用平板分離計數(shù)法的分析結果相一致。張其水等報道，杉木一代林土壤細菌數(shù)量高于二代、三代林，而且各類型細菌組成都隨著杉木連栽代數(shù)的增加而發(fā)生明顯變化［20］。陳楚瑩等報道，杉木純林土壤細菌數(shù)量僅為杉木火力楠混交林的60%左右，并認為土壤微生物數(shù)量與林分中闊葉樹比例呈正相關［5］。

土壤微生物群落結構和多樣性會受多種因素的影響，一些為外因，如植被類型、氣候條件、土壤類型和人類活動等，另外一些為內因，主要為與土壤微生物生長密切相關的土壤有機質組成和土壤養(yǎng)分等。森林土壤有機質主要來源于植被凋落枝葉、地下凋落物、根系分泌物和土壤生物殘體等的分解與周轉。土地利用方式和管理措施能夠影響土壤有機質的數(shù)量和質量，杉木人工林取代天然次生闊葉林后，導致土壤生態(tài)系統(tǒng)中凋落物數(shù)量減少，種類單一化，進而使土壤有機質的含量明顯減少，質量明顯下降［21］。本文研究結果表明杉木純林土壤有機質含量顯著低于自然林和杉闊混交林，通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，土壤有機質的變化與土壤中細菌群落結構及多樣性改變具有顯著正相關。這一結果表明，森林土壤有機物質的質和量影響生態(tài)系統(tǒng)分解者的生長代謝，進而影響土壤中有機質的歸還和養(yǎng)分周轉。

本研究發(fā)現(xiàn)，土壤細菌多樣性指數(shù)和土壤中總有機氮和速效氮含量顯著正相關，這可能與土壤中參與氮素周轉的微生物功能群有關。土壤中氮素含量是生物生長的限制因子，許多研究表明，土壤中氮素含量變化會引起土壤微生物生物量、活性和群落組成的變化［22］。Singh報道土壤微生物直接調節(jié)土壤氮素的供給，土壤中氨化細菌和硝化細菌的數(shù)量及其氨化作用和硝化作用的強弱直接與土壤活性氮素含量相關［23］。因此，在本文基礎上還應該對土壤中參與氮循環(huán)的微生物功能群進行研究，探究其與土壤養(yǎng)分變化之間的相互作用。

土壤細菌群落組成變化是影響土壤質量和植物生長的重要因素。本研究結果顯示，Burkholderia sp.、Sphingobacterium sp.、Xanthomonas sp.和Pedobacter sp.親緣關系密切的細菌種群在不同杉木人工林土壤中有明顯的變化。伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)的某些菌株能夠產(chǎn)生抗真菌的物質，用于防治多種病原真菌引起的農(nóng)作物以及森林苗木的根腐、莖腐、猝倒和紋枯等病害［24-25］。此外，有報道表明伯克霍爾德氏菌屬的某些菌株具有解磷作用，可提高土壤有效磷含量［26］。土地桿菌屬(Pedobacter sp.)的某些菌株能夠產(chǎn)生植酸酶，可分解植物種子中的植酸磷，釋放出肌醇和無機磷，使土壤中有效磷素增加［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，DGGE主成分分析PC1與土壤有效磷呈顯著正相關，可能是由于PC1代表的土地桿菌屬和伯克霍爾德氏菌等解磷細菌數(shù)量和組成的改變引起土壤磷素的變化，進而影響其它種屬土壤微生物(如參與凋落物分解和氮素循環(huán)的微生物)和杉木的生長。另一方面，在南方酸性紅壤地區(qū)土壤全磷含量比較低，這也在一定程度上限制了土壤解磷細菌的生長，導致土壤有效磷含量降低，使土壤微生物(如參與凋落物分解和氮素循環(huán)的微生物)和植物生長受到限制。黃單胞菌屬(Xanthomonas sp.)是一類植物致病菌，能夠引起植物葉片枯萎，甚至造成系統(tǒng)性侵染，致使植株死亡，尤其在雨季傳播力很強［28］。本文研究結果發(fā)現(xiàn)，在自然林及杉木一、二代林土壤中與黃單胞菌屬親緣關系密切的條帶所代表的種群沒有出現(xiàn)，在杉闊混交林土壤中該菌屬細菌不占有優(yōu)勢地位，而在杉木三代林及杉木純林土壤中黃單胞菌屬成為優(yōu)勢種群之一，湖南會同地區(qū)屬于亞熱帶濕潤氣候，雨季較長，這種特殊的氣候條件能夠加速黃單胞菌屬的生長和傳播，因此推測連栽杉木人工林出現(xiàn)的枝條枯萎、生長緩慢和生產(chǎn)力下降可能與土壤中植物病害菌占優(yōu)勢地位有關，對于是何種原因誘導了連栽杉木林土壤中黃單胞菌屬大量繁殖，還有待進一步研究。

3.2 杉木人工林土壤質量變化過程中土壤真菌群落變化特征

本文根據(jù)真菌28SrDNA目的片段的DGGE指紋圖譜，運用PCA分析不同杉木林土壤真菌群落結構的變化，結果發(fā)現(xiàn)其變化趨勢與細菌相反，自然林和杉闊混交林土壤真菌多樣性指數(shù)低于連栽杉木人工林。李延茂等采用可培養(yǎng)技術發(fā)現(xiàn)在杉木林隨著連栽代數(shù)的增加土壤細菌數(shù)量下降而土壤真菌數(shù)量顯著增加［11］，然而并沒有對這一現(xiàn)象進行解釋。本文通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，土壤pH值分別與土壤細菌、真菌群落結構及多樣性指數(shù)變化呈顯著正相關和負相關。土壤pH值一直被認為是影響土壤微生物群落結構的重要因素，土壤細菌和真菌分別在偏堿性和偏酸性土壤中占據(jù)優(yōu)勢地位［29］。土壤pH值能夠通過影響土壤基質的組成、化學性質和利用效率而使土壤微生物群落組成和多樣性受到干擾。本文研究顯示，自然林和杉闊混交林土壤pH值高于連栽杉木人工林，不斷連續(xù)栽種杉木純林會導致土壤酸化。與闊葉樹相比，針葉樹凋落物富含較多的蠟質、樹脂和木質素等分解產(chǎn)酸性物質，單一針葉樹種的大面積種植可由于其凋落物質和量引起土壤酸化，這在我國南方普遍存在。然而當闊葉樹種引入杉木人工林種植管理中，可以扭轉該現(xiàn)象的發(fā)生?？梢?，造林管理措施能夠通過影響凋落物的組成而引起土壤pH變化，進而改變土壤微生物群落結構組成。

土壤碳氮比是影響土壤微生物群落結構變化的又一重要因子。本研究結果表明土壤真菌群落結構及多樣性指數(shù)變化與土壤C/N呈顯著正相關。采用相同的方法，Yao等研究表明土壤真菌多樣性隨著土壤C/N增加而變化，并認為高C/N的土壤基質可能富含木質素和多酚類物質，這些物質能夠誘導某些真菌生長［30］。此外，采用PFLA方法，Hackl等評價12種森林土壤中真菌多樣性和豐度的變化，結果發(fā)現(xiàn)針葉樹種森林土壤有機質具有高的碳氮比，同樣也具有更為豐富的真菌類群，他們推測某些真菌類群適應針葉樹森林土壤的高C/N，通過其菌絲轉化更多的土壤有機碳［31］。

本研究發(fā)現(xiàn)杉木一、二代林與自然林土壤真菌群落結構組成變化不大，但是杉木三代林土壤真菌群落結構變化劇烈，出現(xiàn)了一些特征菌屬，其中包括核盤菌屬、球殼菌屬和小皮傘菌屬等，這些菌屬的出現(xiàn)可能與該林分土壤質量和生產(chǎn)力下降有關。核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一種植物病原菌，由其引起的菌核病是世界性分布的重要病害。自從20世紀70年代，國外就開始報道了該菌屬是花旗松(Douglas fir)、冷杉和銀杉(Abies amabilis)等經(jīng)濟林木重要致病真菌［32］。球殼菌屬(Mycosphaerella sp.)也包含了許多危害嚴重的植物病原菌，如美洲的松針紅斑病菌(Mycosphaerella pini)能夠引起針葉樹病害［33］，Mycosphaerella aleuritidis是我國云南油桐黑斑病的致病菌［34］。據(jù)報道小皮傘菌屬(Marasmius sp.)主要生長在腐爛的枯枝落葉上，是一類凋落物分解菌屬，曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)其為我國小興安嶺楓樺紅松林凋落物分解菌之一［35］。本文研究發(fā)現(xiàn)，小皮傘菌屬是杉木三代林土壤真菌的優(yōu)勢種群，這可能與杉木純林凋落物極難分解，誘導一些木腐真菌的生長有關，但對這一推測還需進一步研究證實。通過統(tǒng)計學分析，本文發(fā)現(xiàn)親緣關系與這些菌屬相關的條帶在真菌DGGE主成分分析PC2的載荷較大，PC2與土壤質量顯著負相關，推測杉木人工林土壤質量衰退，生產(chǎn)力下降可能與植物致病真菌占優(yōu)勢地位有關。

土壤真菌DGGE主成分分析PC1代表自然林和杉闊混交林主要種群信息，其種群數(shù)量和組成在杉木人工林取代自然林以及杉木和闊葉樹混交這些造林活動過程中均發(fā)生了改變，Sphaerobolus sp.是與土壤有機質的分解有關［36］，Creosphaeria sp.某些菌株能夠產(chǎn)生抗菌物質［37］，而有些種屬Tubeufia sp.和Serendipita sp.尚未有具體生態(tài)功能的報道。它們的變化與本文所研究的多數(shù)土壤養(yǎng)分變化并不直接相關，但是這些類群優(yōu)勢地位的喪失和恢復對于維持土壤真菌群落的穩(wěn)定具有重要的意義，杉木三代林土壤中這些種屬真菌受到擾動劇烈，一些種群消失，取而代之的植物致病菌占據(jù)優(yōu)勢地位，土壤原有真菌群落結構平衡被破環(huán)，同時土壤細菌群落結構也被破壞，嚴重影響土壤物質周轉和養(yǎng)分循環(huán)，表4中真菌DGGE主成分分析PC2與土壤總有機碳氮、可溶性碳、銨態(tài)氮和有效磷變化顯著負相關，證實了上述論述。

目前，對于上述微生物種屬在杉木人工林土壤中尚未見報道，本文通過不依賴于培養(yǎng)的分子生物學技術，發(fā)現(xiàn)湖南會同地區(qū)供試杉木人工林土壤細菌和真菌優(yōu)勢種群，尤其是與土壤養(yǎng)分循環(huán)和植物病害有關的微生物種群發(fā)生變化，并詳細分析了土壤細菌種群變化與土壤化學性質變化的關系。后續(xù)研究將對重要的土壤微生物功能群進一步探討，如參與氮素循環(huán)的微生物功能群變化及其與土壤氮素周轉之間的關系;參與凋落物分解的微生物功能群種群組成的變化及其與有機質歸還之間的關系;拮抗致害真菌的微生物功能群的變化及其與土壤自凈功能之間的關系等諸多問題。對這些科學問題的解答能夠進一步解釋杉木人工林經(jīng)營引起土壤質量變化的微生物機理，并為制定合理造林管理措施提供理論依據(jù)。

致謝:感謝中國科學院會同森林生態(tài)實驗站陳楚瑩、馮宗煒、廖利平和汪思龍營造的杉木實驗林，本實驗是在他們研究樣地的基礎上進行的。

［1］ Fang Q.Effects of continued plating of Chinese fir on the fertility of soil and the growth of stands.Scientia Silvae Sinicae，1987，23(4):389-397.

［2］ Yu X T.A summary of the studies on the plantation productivity and nutrient cycling in Chinese fir plantation ecosystem.Journal of Fujian College of Forestry，1992，12(3):264-276.

［3］ Yang C D，Zhang X Q，Jiao R Z，Wei Y R.Variations of chemical properties，biochemical，microoganism activities and function in soil of successive rotation of Chinese fir and their influences on growing.Scientia Silvae Sinicae，1996，32(2):175-181.

［4］ Chen C Y，Liao L P，Wang SL.Chinese fir plantation Ecology.Beijing:Science press，2000.

［5］ Lejon D P H，Chaussod R，Ranger J，Ranjard L.Microbial community structure and density under different tree species in an acid forest soil(Morvan，F(xiàn)rance).Microbial Ecology，2005，50(4):614-625.

［6］ Zak D R，Holmes W E，White D C，Peacock A D，Tilman D.Plant diversity，soil microbial communities，and ecosystem function:are there any links?Ecology，2003，84(8):2042-2050.

［7］ Priha O，Grayston S J，Hiukka R，Pennanen T，Smolander A.Microbial community structure and characteristics of the organic matter in soils under Pinus sylvestris，Picea abies and Betula pendula at two forest sites.Biology and Fertility of Soils，2001，33(1):17-24.

［8］ Kirk JL，Beaudette L A，Hart M，Moutoglis P，Klironomos J N，Lee H，Trevors J T.Methods of studying soil microbial diversity.Journal of Microbiological Methods，2004，58(2):169-188.

［9］ Leckie SE，Prescott C E，Grayston SJ，Neufeld J D，Mohn W W.Characterization of humus microbial communities in adjacent forest types that differ in nitrogen availability.Microbial Ecology，2004，48(1):29-40.

［10］ Chen C Y，Zhang JW，Zhou C L，Zheng H Y.Researches on improving the quality of forest land and the productivity of artificial Cunninghamia lanceolata stands.Chinese Journal of Applied Ecology，1990，1(2):97-106.

［11］ Li Y M，Hu JC，Zhang J，Wang SL，Wang SJ.Microbial diversity in continuously planted Chinese fir soil.Chinese Journal of Applied Ecology，2005，16(7):1275-1278.

［12］ Liang B C，Mackenzie A F，Schnitzer M，Monreal C M，Voroney P R，Beyaert R P.Management-induced change in labile soil organic matter under continuous corn in eastern Canadian soils.Biology and Fertility of Soils，1997，26(2):88-94.

［13］ Liu G S.Standard method of observation and analysis of the Chinese ecosystem research network-analysis of the soil physicochemical characteristics and delineation of the soil profiles.Bei Jing:Standard press.1996.

［14］ Zhou JZ.Microarrays for bacterial detection and microbial community analysis.Current Opinion in Microbiology，2003，6(3):288-294.

［15］ Wu M N，Zhang H W，Li X Y，Su Z C，Zhang C G.An extraction method of fungal DNA from soils in North China.Chinese Journal of Ecology，2007，26(4):611-616.

［16］ Muyzer G，Brinkhoff T，Nübel U，Santegoeds C，Sch?fer H，Wawer C.Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)in microbial ecology//Akkermans A D L，van Elsas J D，de Bruijn F J，eds.Molecular Microbial Ecology Manual.Boston:Kluwer Academic Publishing，2004:743-769.

［17］ Sandhu G S，Kline B C，Stockman L，Roberts GD.Molecular probes for diagnosis of fungal infections.Journal of Clinical Microbiology，1995，33(11):2913-2919.

［18］ Liu L，Duan Z H，Wang SL，Hu JC，Hu Z G，Zhang Q R，Wang SJ.Effects of Cunninghamia lanceolata plantations at different developmental stages on soil microbial community structure.Chinese Journal of Ecology，2009，28(12):2417-2423.

［19］ Xue D，Yao H Y，Huang CY.Genetic diversity of microbial communities in tea orchard soil.Chinese Journal of Applied Ecology，2007，18(4):843-847.

［20］ Zhang Q S，Yu X T.Seasonal dynamics of the soil microorganism in the repeated Chinese fir plantation woodlands.Journal of Fujian College of Forestry，1991，11(4):422-427.

［21］ Wu W D，Zhang T L，Sun B，Zhao Q G.Degradation and control of soil organic matter and nutrient pool under artificial Chinese fir forest.Acta Pedologica Sinica，2000，37(1):41-49.

［22］ Sarathchandra SU，Ghani A，Yeates GW，Burch G，Cox N R.Effect of nitrogen and phosphate fertilizers on microbial and nematode diversity in pasture soils.Soil Biology and Biochemistry，2001，33(7/8):953-964.

［23］ Singh J S，Kashyap A K.Contrasting pattern of methanotrophs in dry tropical forest soils:effect of soil nitrogen，carbon and moisture.Microbiological Research，2007，162(3):276-283.

［24］ Cartwright D K，Benson D M.Pseudomonas cepacia strain 5.5 B and method of controlling Rhizoctonia solani:United State Patent，5288633.1994-02-22.

［25］ Xie G L，Jin Y X，Xu C Y，Ren X P，Yu X F，Mew W T.Bacterial antagonists of rice sheath blight disease in China.Chinese Journal of Biological Control，2003，19(4):166-170.

［26］ Wang Y，Yu X M，He CP，Zheng F C.Screening and identification of one strain of phosphate-solubilizing bacteria from the tropical soil and the study on its antagonism.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2009，37(18):8347-8349.

［27］ Gomez A A，Kelly D E S，Syers J K，Coughlan K J.Measuring sustainability of agricultural systems at the farm level//Doran JW，Jones A J，eds.Methods for Assessing.Madison:Soil Science Society of America Special Publication，1996，49:401-409.

［28］ Soustrade I，Gagnevin L，Roumagnac P，Gambin O，Guillaumin D，Jeuffrault E.First report of anthurium blight caused by Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae in Reunion Island.Plant Disease，2000，84(12):1343-1343.

［29］ Ogilvie L A，Hirsch P R，Johnston A W B.Bacterial diversity of the Broadbalk‘Classical’winter wheat experiment in relation to long-term fertilizer inputs.Microbial Ecology，2008，56(3):525-537.

［30］ Yao SR，Merwin I A，Bird G W，Abawi G S，Thies J E.Orchard floor management practices that maintain vegetative or biomass groundcover stimulate soil microbial activity and alter soil microbial community composition.Plant and Soil，2005，271(1/2):377-389.

［31］ Hackl E，Pfeffer M，Donat C，Bachmann G，Zechmeister-Boltenstern S.Composition of the microbial communities in the mineral soil under different types of natural forest.Soil Biology and Biochemistry，2005，37(4):661-671.

［32］ Berry JA，Dolezal W E，Sayers A C.Remote imaging system for plant diagnosis.USPatent 6014451，2000-01-11.

［33］ Xu H G，Qiang S，Han ZM，Guo JY，Huang Z G，Sun H Y，He SP，Ding H，Wu H R，Wan F H.The distribution and introduction pathway of alien invasive species in China.Chinese Biodiversity，2004，12(6):626-638.

［34］ Chen P，Liu H P，Wang D M，Bai R L.Dangerousness analysis of Mycosphaerella aleuritidis.forest inventory and planning.Forest Inventory and Planning，2006，31(2):116-118.

［35］ Pan X R，Huang Y Q，Liu C Z.Study on decomposition mycoflora in costata birch-Korean pine forest litters.Journal of Northeast Forestry University，1991，19(1):75-82.

［36］ Yu SL.A study of function that rot funguses have in the decomposition of organic matter.Journal of Hebei Normal University:Natural Science，2003，27(5):519-522.

［37］ Quang D N，Hashimoto T，F(xiàn)ournier J，Stadler M，Radulovi N，Asakawa Y.Sassafrins A D，new antimicrobial azaphilones from the fungus Creosphaeria sassafras.Tetrahedron，2005，61(7):1743-1748.

參考文獻:

［1］ 方奇.杉木連栽對土壤肥力及其林木生長的影響.林業(yè)科學，1987，23(4):389-397.

［2］ 俞新妥.杉木人工林地力和養(yǎng)分循環(huán)研究進展.福建林學院學報，1992，12(3):264-276.

［3］ 楊承棟，張小泉，焦如珍，魏以榮，馮福娟.杉木連栽土壤組成、結構、性質變化及其對林木生長的影響.林業(yè)科學，1996，32(2):175-181.

［4］ 陳楚瑩，廖利平，汪思龍.杉木人工林生態(tài)學.北京:科學出版社，2000.

［10］ 陳楚瑩，張家武，周崇蓮，鄭洪元.改善杉木人工林的林地質量和提高生產(chǎn)力的研究.應用生態(tài)學報，1990，1(2):97-106.

［11］ 李延茂，胡江春，張晶，汪思龍，王書錦.杉木連栽土壤微生物多樣性的比較研究.應用生態(tài)學報，2005，16(7):1275-1278.

［13］ 劉光崧.中國生態(tài)系統(tǒng)研究網(wǎng)絡觀測與分析標準方法-土壤理化分析與剖面描述.北京:標準出版社，1996.

［15］ 吳敏娜，張惠文，李新宇，蘇振成，張成剛.提取北方土壤真菌DNA的一種方法.生態(tài)學雜志，2007，26(4):611-616.

［18］ 劉麗，段爭虎，汪思龍，胡江春，胡治剛，張倩茹，王書錦.不同發(fā)育階段杉木人工林對土壤微生物群落結構的影響.生態(tài)學雜志，2009，28(12):2417-2423.

［19］ 薛冬，姚槐應，黃昌勇.茶園土壤微生物群落基因多樣性.應用生態(tài)學報，2007，18(4):843-847.

［20］ 張其水，俞新妥.杉木連栽林地土壤微生物的季節(jié)動態(tài)研究.福建林學院學報，1991，11(4):422-427.

［21］ 吳蔚東，張?zhí)伊?，孫波，趙其國.人工杉木林地有機物和養(yǎng)分庫的退化與調控.土壤學報，2000，37(1):41-49.

［25］ 謝關林，金揚秀，徐傳雨，任小平，余雪芳，Mew W T.我國水稻紋枯病拮抗細菌種類研究.中國生物防治，2003，19(4):166-170.

［26］ 王義，余賢美，賀春萍，鄭服叢.一株熱帶土壤解磷細菌的篩選鑒定及拮抗初探.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37(18):8347-8349.

［33］ 徐海根，強勝，韓正敏，郭建英，黃宗國，孫紅英，何舜平，丁暉，吳海榮，萬方浩.中國外來入侵物種的分布與傳入路徑分析.生物多樣性，2004，12(6):626-638.

［34］ 陳鵬，劉宏屏，王達明，白如禮.云南油桐黑斑病危險性分析.林業(yè)調查規(guī)劃，2006，31(2):116-118.

［35］ 潘學仁，黃永青，劉傳照.楓樺紅松林凋落物分解真菌生態(tài)群的研究.東北林業(yè)大學學報，1991，19(1):75-82.

［36］ 于淑玲.腐生真菌在有機質分解過程中的作用研究進展.河北師范大學學報:自然科學版，2003，27(5):519-522.