竹節(jié)參總皂苷對慢性腦缺血大鼠海馬GFAP、GAP－43表達(dá)的影響

王 敏 張秋霞 鄒海艷 趙 暉 李 佳

(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京，100069)

竹節(jié)參是五加科植物竹節(jié)參(Panax Japonicus C.A Meyer)根莖，為國家珍稀名貴藥材。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參的主要活性部位－竹節(jié)參總皂苷(Total Saponins of Panax japonicus，TSPJ)可以改善慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力［1］。為進(jìn)一步探討藥物作用的機制，本研究擬觀察竹節(jié)參總皂苷對慢性腦缺血大鼠海馬腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和生長相關(guān)蛋白GAP－43表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)重280～300g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供［合格證號SCXK(京)2006－0009］。飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［許可證號SYXK(京)2005－0022］。12h光照/黑暗周期，環(huán)境溫度(22±1)℃。動物自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)3天后正式進(jìn)行實驗。

1.2 藥物 竹節(jié)參藥材，購于湖北，由首都醫(yī)科大學(xué)李佳副教授鑒定為五加科人參屬植物竹節(jié)參(Panax japonicus C.A.Mey.)的干燥根莖。TSPJ得率9.58%，由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥化學(xué)實驗室提供，為淡黃色粉末(批號:20080707)，臨用前以生理鹽水稀釋至所需濃度。

1.3 試劑 兔抗鼠GFAP單克隆抗體、兔抗鼠GAP－43單克隆抗體羊抗兔IgG均購自Epitomics公司;抗β－Actin兔多克隆抗體、Tis－組織蛋白抽提試劑、BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.4 儀器 BIO－RAP MODEL 680型酶標(biāo)儀，北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司;垂直電泳槽，美國BIORAD公司;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀/電轉(zhuǎn)儀，美國BIO－RAD公司生產(chǎn)。

2 實驗方法

2.1 動物分組 60只SD雄性大鼠體重(280～300g)，用隨機數(shù)字表方法將實驗動物隨機分為4組，即假手術(shù)組、模型組、TSPJ組(200、100mg·kg－1)，每組10只動物。

2.2 模型制備 參考文獻(xiàn)方法［2］，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠仰臥固定，頸前部正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，進(jìn)行永久性結(jié)扎，縫合傷口。假手術(shù)組大鼠僅游離雙側(cè)頸總動脈后縫合傷口，各組大鼠同條件飼養(yǎng)。

2.3 給藥 造模24h開始給藥，每日1次，連續(xù)給藥30天后進(jìn)行各項指標(biāo)檢測。假手術(shù)組及模型組動物灌胃給等容量生理鹽水。

2.4 海馬GFAP GAP－43蛋白檢測 動物，斷頭處死，迅速在冰盒中分離海馬組織，放置液氮;Tis－蛋白抽提試劑抽提海馬組織蛋白，BCA法蛋白定量;10%的SDS－PAGE凝膠電泳，上樣量為10μg，電泳結(jié)束后，進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜;與GAP－43一抗(1:100 00)、GFAP一抗(1:200 00)雜交反應(yīng);再將NC膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:100 00)雜交反應(yīng)1h，在暗室進(jìn)行X－光膠片曝光、顯影和定影。然后用同一張NC膜與內(nèi)參GAPDH(1:100 00)進(jìn)行雜交反應(yīng)。采用YLN－2000凝膠影像分析系統(tǒng)分析目的條帶，目的蛋白吸光度值和內(nèi)參蛋白吸光度值的比值，作為目的蛋白表達(dá)的相對水平。

2.5 統(tǒng)計方法 運用SPSS 10.0進(jìn)行方差分析，LSD檢驗比較兩組間差異。結(jié)果以(s)表示。

3 結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，慢性腦缺血30天大鼠海馬GFAP表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01);TRPJS能明顯上調(diào)海馬GAP－43蛋白的表達(dá)，下調(diào)海馬GFAP蛋白的表達(dá)，與模型組差異顯著(P＜0.01)。

表1 各組大鼠海馬GAP－43、GFAP蛋白的相對表達(dá)量(s，n=5)

表1 各組大鼠海馬GAP－43、GFAP蛋白的相對表達(dá)量(s，n=5)

注:與模型組相比，＊＊P ＜0.01。

GAP－43/GAPDH GFAP/GAPDH假手術(shù)組 － 0.85±0.10 0.93±0.10分組 劑量/mg·kg－1＊＊模型組 － 0.74±0.16 1.83±0.11 TSPJ 100 1.02±0.14＊＊ 1.22±0.21＊＊TSPJ 200 1.13±0.16＊＊ 0.96±0.32＊＊

圖1 Western blot檢測大鼠海馬GAP－43、GFAP蛋白的表達(dá)

4 討論

突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)基礎(chǔ)，海馬直接參與信息貯存和回憶，是腦內(nèi)參與記憶貯存功能的重要部分，慢性腦缺血可損害海馬突觸可塑性引起學(xué)習(xí)記憶能力下降［3］。GAP－43對新突觸形成及功能完善具有顯著的調(diào)控作用［4］。成年大部分腦區(qū)GAP－43表達(dá)水平較低，新皮質(zhì)、嗅球和海馬GAP－43mRNA一直保持在較高水平。損傷時，這些區(qū)域的神經(jīng)元都表現(xiàn)為側(cè)枝出芽和反應(yīng)性軸突再生，并伴隨著GAP－43表達(dá)增高，這是機體自我修復(fù)的一種正常反應(yīng)［5］。本次實驗中，我們觀察到慢性腦缺血30天后，海馬GAP－43的表達(dá)較假手術(shù)組有降低趨勢，結(jié)果提示，機體內(nèi)源性修復(fù)能力有限，GAP－43的表達(dá)會隨著缺血時間的延長而逐步降低。星形膠質(zhì)細(xì)胞在節(jié)突觸可塑性及突觸功能活動中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用［6］。GFAP作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及增殖的標(biāo)志物之一，腦缺血后海馬出現(xiàn)的過度增殖的膠質(zhì)細(xì)胞以及膠質(zhì)疤痕的形成不僅影響到正常的局部神經(jīng)回路，而且可能是繼發(fā)癲癇以及認(rèn)知功能損害的重要因素［7］。因此調(diào)節(jié)GAP－43表達(dá)，有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度增殖，防止膠質(zhì)疤痕的形成是腦保護(hù)的研究重點。

竹節(jié)參是五加科植物竹節(jié)參Panax Japonicus C.A Meyer根莖，為國家珍稀名貴藥材。早在清代《綱目拾遺》中有載，稱其為“血癥良藥”。竹節(jié)參與人參和三七是同科同屬的植物，目前的研究認(rèn)為，皂苷是人參屬植物的主要有效成分。竹節(jié)參的化學(xué)研究證實竹節(jié)參中的皂苷既有齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷，也有在人參和三七中活性最顯著的達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷以及甾體皂苷。本實驗室前期研究工作發(fā)現(xiàn)——竹節(jié)參的有效活性部位，總皂苷對多種腦缺血模型有很好的保護(hù)作用，能夠改善腦缺血動物的神經(jīng)功能癥狀和血液流變學(xué)指標(biāo)，減輕腦組織病理形態(tài)學(xué)改變，同時能夠提高擬血管癡呆模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力［8－10］，本次研究發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參總皂苷可上調(diào)慢性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)生長相關(guān)蛋白GAP－43的表達(dá)，降低海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生有一定的相關(guān)性。

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