虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇含量標(biāo)準(zhǔn)值與不確定度評估分析方法研究

劉淑聰，張寶喜，楊世穎，馬 林，呂 揚(yáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院·中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，藥物晶型研究中心，晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

虎杖為蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖及根，主要有效成分為蒽醌類及芪類化合物，具有清熱解毒、利膽退黃、祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰的功效，屬常用中藥材品種[1]。中藥材的質(zhì)量控制一直是困擾中藥研究與應(yīng)用的技術(shù)難點(diǎn)和重點(diǎn)科學(xué)問題，而其中應(yīng)用到的多種儀器技術(shù)與分析方法尚缺少大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)加以驗(yàn)證。因此，中藥有效、定量、準(zhǔn)確的質(zhì)量控制技術(shù)和方法屬我國亟待解決的重要科學(xué)問題。國際上對藥品質(zhì)量控制的趨勢已從僅提供藥物的有效成分含量值，發(fā)展到需要提供藥物有效成分的標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度值，即將藥品的一般標(biāo)準(zhǔn)提升為計量標(biāo)準(zhǔn)，以保證藥品質(zhì)量控制的量值溯源性和準(zhǔn)確性。雖已有文獻(xiàn)對中藥材虎杖成分含量的報道，但目前尚未見關(guān)于其成分含量標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度評估方法的報道?，F(xiàn)將國際計量標(biāo)準(zhǔn)研究引入到對我國中藥復(fù)雜體系成分的含量研究中，通過國家一級有證計量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)虎杖苷化學(xué)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW09566)、白藜蘆醇化學(xué)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW09536)的量值傳遞，實(shí)現(xiàn)對中藥材虎杖中兩種成分的含量標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度評價研究，旨在對我國現(xiàn)有分析技術(shù)和方法進(jìn)行補(bǔ)充和完善。本研究中選用的安徽產(chǎn)虎杖中藥材，經(jīng)質(zhì)量檢查符合2010年版《中國藥典(一部)》的要求[2]，研究方法則依據(jù)《中華人民共和國計量法》《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范》(JJF1006－1994)及《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理辦法》等[3－5]相關(guān)技術(shù)文件的要求?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器和試藥

美國Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括DAD檢測器、Agilent chemstation工作站;Mettler XS105型分析用天平(感量0.01mg);SHH.W21.420型三用電熱恒溫水箱(北京精科華瑞儀器有限公司)。國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):虎杖苷化學(xué)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，編號為 GBW 09566，純度標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度值為(99.6±0.7)%(k=2，P=0.95);白藜蘆醇化學(xué)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，編號為GBW09536，純度標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度值為(99.4 ±0.5)%(k=2，P=0.95)。虎杖中藥材，產(chǎn)地安徽，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所馬林教授鑒定為正品，樣品經(jīng)除塵、粉碎、并過50目篩，備用;精密稱取1 g樣品，置棕色安瓿瓶密封包裝，共完成了500支最小包裝1 g量的中藥材虎杖成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品的制備工作。甲醇(Fisher Chemical，色譜純);無水乙醇(分析純，北京化工廠);娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定(高效液相色譜法)

2.1.1 色譜條件[6－7]

色譜柱:Agilent XDB C18(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇 －水(40∶60);流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10μL;檢測波長:306 nm。

2.1.2 溶液制備

精密稱取虎杖苷、白藜蘆醇化學(xué)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，分別置50mL容量瓶中，用50%乙醇將樣品完全溶解，并定容至刻度，搖勻，配制成每1mL溶液中分別含虎杖苷166μg，白藜蘆醇145μg的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密移取 0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL 分別置10mL容量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，得虎杖苷質(zhì)量濃度分別為 1.66，8.29，16.60，33.20，82.90，166.00 μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度分別為 1.45，7.23，14.50，28.90，72.30，145.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。取中藥材虎杖約100mg，精密稱定，精密加入50%乙醇25mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30min，冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):分別吸取虎杖苷、白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液按擬訂的色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖1。可見，虎杖苷與白藜蘆醇的分離度好，且周圍無其他色譜峰干擾，表明擬訂的色譜條件可行。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密移取6種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸?；⒄溶丈V峰面積值分別為 69.18，354.3，709.5，1 461，3 592，7 227，回歸方程為 Y=43.604X －4.880 2，r2=1.000 0(n=6);白藜蘆醇色譜峰面積值分別為 108.6，520.0，1 063，2 125，5 351，10 766，回歸方程為 Y=74.533X －17.083，r2=1.000 0(n=6)。結(jié)果表明，虎杖苷和白藜蘆醇質(zhì)量濃度分別在1.7～165.7μg/mL和1.5～144.5μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取虎杖苷、白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)貯備液1mL，置10mL容量瓶，50%乙醇稀釋至刻度，按擬訂的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖;結(jié)果虎杖苷峰面積值分別為714.8，715.3，714.4，715.5，715.7，716.0，白藜蘆醇峰面積值分別為1 066，1 072，1 065，1 071，1 066，1 065，RSD 分別為 0.08% 和0.30%(n=6)，表明儀器精密度良好。精密移取虎杖苷與白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)儲備液1mL，置10mL容量瓶中，各6份，用50%乙醇稀釋至刻度，按擬訂的色譜條件各重復(fù)進(jìn)樣3次，分別記錄色譜圖;結(jié)果虎杖苷峰面積均值分別為 713.1，715.1，713.1，715.2，714.6，712.3，白藜蘆醇峰面積均值分別為 1 068，1 051，1 065，1 062，1 064，1 065，RSD 分別為 0.17% 和 0.54%(n=6)，表明方法精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):稱取中藥材虎杖樣品6份，每份100mg，依法制備供試品溶液，按擬訂的色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果虎杖苷相對百分含量分別為 1.486% ，1.486% ，1.504% ，1.500% ，1.489% ，1.481%，平均含量為 1.491%，RSD 為 0.60%(n=6);白藜蘆醇相對百分含量分別為 0.298% ，0.294% ，0.292% ，0.292% ，0.294% ，0.290% ，平均含量為 0.293% ，RSD 為 1.03%(n=6)，可見，供試品溶液制備方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，避光放置，分別于配制后0，4，8，12，16，24 h 時[5－6]依法進(jìn)樣測定。結(jié)果虎杖苷相對百分含量 分 別 為 1.491% ，1.494% ，1.496% ，1.488% ，1.499% ，1.483%，RSD為0.38%(n=6);白藜蘆醇相對百分含量分別為0.300% ，0.304% ，0.298% ，0.307% ，0.301% ，0.306% ，RSD 為1.19%(n=6)?？梢姽┰嚻啡芤涸?4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

回收率試驗(yàn):稱取中藥材虎杖樣品6份，每份100mg，再加入已知含量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(虎杖苷1.49%，白藜蘆醇0.29%)，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測定含量，計算回收率。結(jié)果虎杖苷回收率分別為 98.52% ，99.72% ，99.24% ，99.39% ，99.15% ，98.86%，平均 99.15%，RSD 為 0.42%(n=6);白藜蘆醇回收率分別為 99.76%，99.87%，98.96%，99.34%，99.89%，99.72%，平均99.59%，RSD 為 0.37%(n=6)?？梢?，方法回收率良好。

2.1.4 均勻性試驗(yàn)

從500支中藥材虎杖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物中隨機(jī)抽取15瓶樣品，每瓶樣品均按供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂的色譜條件測定含量，共獲得45個均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，見表1。采用單因素方差分析[7－8]對均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行組內(nèi)和組間統(tǒng)計分析，測定虎杖苷含量時 F值為1.71，測定白藜蘆醇含量時 F值為1.63，F(xiàn)0.05(14，30)=2.04，即 F ＜ F0.05(14，30)。結(jié)果表明，中藥材虎杖成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品具有良好的均勻性。

表1 虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇含量均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.1.5 長期穩(wěn)定性試驗(yàn)

將密封包裝后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品放置在常溫條件下長期保存，考察其穩(wěn)定性，并分別于 0，1，2，4，6，12 月時隨機(jī)抽樣，每個點(diǎn)隨機(jī)抽樣6瓶，依法測定虎杖苷和白藜蘆醇含量。測定結(jié)果見表2。以保存時間(X)，成分含量(Y)分別擬合兩種化學(xué)成分的直線，得直線回歸方程，計算斜率的不確定度[8－9]，結(jié)果如下?；⒄溶誝=0.000 005X+0.0149，白藜蘆醇 Y= －0.000 000 8X+0.003，

表2 虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇成分含量長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

二者的自由度均為 n－2=6－2=4和 P=0.95(95%置信區(qū)間)的 t因子等于2.776，由于虎杖苷和白藜蘆醇含量測定值|a|＜×S(a)，故斜率是不顯著的，表明中藥材虎杖成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物在12個月內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2 成分含量標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度評估

2.2.1 成分含量標(biāo)準(zhǔn)值定值

依據(jù)國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范的定值，采用6家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值方法實(shí)現(xiàn)對中藥材虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇成分進(jìn)行定值。結(jié)果見表3。采用格拉布斯檢驗(yàn)，剔除可疑值，并采用科克倫(Cochran)等精度檢驗(yàn)，證明虎杖苷含量和白藜蘆醇含量的測量數(shù)據(jù)均屬等精度數(shù)據(jù)。計算得6家聯(lián)合定值的中藥材虎杖中虎杖苷含量標(biāo)準(zhǔn)值 P1=1.473%，S1=0.000 021 4;白藜蘆醇含量標(biāo)準(zhǔn)值 P2=0.294%，S2=0.000 026 6。

2.2.2 不確定度評定

1)成分含量標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度評估

經(jīng)分析可知，其標(biāo)準(zhǔn)值的總不確定度由5個部分組成:由虎杖苷和白藜蘆醇國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度值;由測量數(shù)據(jù)的不確定度引入的不確定度，包括了中藥材中有效成分提取及含量測定過程引入的不確定度;由聯(lián)合定值的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度;由樣品不均勻性引入的不確定度;由樣品穩(wěn)定性引入的不確定度。這5個部分不確定度構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)值的總不確定度[8－11]。

表3 虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇成分含量的聯(lián)合定值數(shù)據(jù)

2)不確定度的量化分析

國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度值 urel(p):虎杖苷純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值為(99.6±0.7)%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度值為0.7%/2=0.35% ，相 對 標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 值 為 urel(p1)=0.35%/99.6%=0.003 514。白藜蘆醇純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值為(99.4 ±0.5)%，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度值為0.5%/2=0.25%，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度值為urel(p2)=0.25%/99.4%=0.002 515。測量數(shù)據(jù)的不確定度值urel(j)。

聯(lián)合定值的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度值 urel(f):按照國際標(biāo)準(zhǔn)化組織標(biāo)準(zhǔn)物指南35(以下簡稱指南35)規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)偏差計算公式為 urel(f)=u(c1)/c1。

S(A)為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差，m為中藥材虎杖溶液的測定次數(shù)，n為標(biāo)準(zhǔn)溶液的總測定次數(shù)，C0為標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(μg/mL)，C1為中藥材虎杖溶液的質(zhì)量濃度(μg/mL)，i為校準(zhǔn)溶液的第 n次測量。以檢測樣品的溶液質(zhì)量濃度為 X、峰面積 Y擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線而獲得直線。聯(lián)合標(biāo)定單位的標(biāo)準(zhǔn)曲線相對不確定度 urel(f)值結(jié)果見表4，取其中的最大值計算。

表4 聯(lián)合定值標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對不確定度數(shù)據(jù)

樣品均勻性引入的不確定度 urel(SH):由均勻性產(chǎn)生的不確定度可按照指南35規(guī)定，數(shù)學(xué)模型為

式中 SH表示均勻性產(chǎn)生的不確定度，n表示測定次數(shù)，MS組間表示組間均方差，MS組內(nèi)表示組內(nèi)均方差。表5給出中藥材虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇成分含量均勻性產(chǎn)生的不確定度數(shù)據(jù)，其中虎杖苷為 5.32 ×10－5，白藜蘆醇為 2.32 ×10－5，與測量產(chǎn)生的不確定度相比，均勻性產(chǎn)生的不確定度較小，可以忽略。

表5 虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇成分含量均勻性產(chǎn)生的不確定度數(shù)據(jù)

樣品穩(wěn)定性引入的不確定度 urel(St):

式中 S(α)表示斜率產(chǎn)生的不確定度，S表示直線的標(biāo)準(zhǔn)偏差，Xi表示時間點(diǎn)，表示時間均值，St表示穩(wěn)定性產(chǎn)生的不確定度，t表示時間。由穩(wěn)定性產(chǎn)生的不確定度值，虎杖苷 urel(St1)=12 × Sα1=1.64×10－4;白藜蘆醇 urel(St2)=12 ×Sα2=1.68 × 10－5。3)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算

式中，uc(x)表示前3部分合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，urel(p)表示國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度值，urel(j)表示測量數(shù)據(jù)引入的不確定度值，urel(f)表示聯(lián)合定值的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度值。計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，虎杖苷 uc(x1)=0.006 76%，白藜蘆醇 uc(x2)=0.003 79%。

4)總合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

式中，uc(總)表示總合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，uc(x)表示前3部分合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，urel(SH)表示樣品均勻性引入的不確定度，urel(St)表示樣品穩(wěn)定性引入的不確定度。計算總合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，虎杖苷 uc(總1)=0.0001855，白藜蘆醇 uc(總2)=0.000047 5。

5)擴(kuò)展不確定度

數(shù)學(xué)模型:U=k×uc(總)。式中，U表示擴(kuò)展不確定度，k表示包含因子，uc(總)表示總合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。k取2，P=95%，計算擴(kuò)展不確定度，虎杖苷 U1=0.037 1%，白藜蘆醇 U2=0.009 5%。

6)成分含量標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度表示

在測量不確定度的最終計算中，一般采用只進(jìn)不舍的規(guī)則。故中藥材虎杖中，虎杖苷含量標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度值為(1.47±0.04)%，k=2，P=0.95;白藜蘆醇含量標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度值為(0.29 ±0.01)%，k=2，P=0.95。

3 討論

本研究成功地賦予復(fù)雜體系中藥材虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇含量的標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度值，為國際公認(rèn)的有證計量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制，提供了有效的檢測技術(shù)、全面的計算數(shù)學(xué)模型、標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度的評估方法，對我國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制具有較好的技術(shù)示范作用。

中藥材有證國家級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究在我國剛剛起步，本研究將為我國中藥材乃至中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高、與國際公認(rèn)的計量標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)接軌、推動中藥的標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化，提供了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)方法。

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