正交試驗(yàn)優(yōu)化杜仲葉中綠原酸的超聲提取工藝

王柏強(qiáng) ，劉 福 ，江承平 ，何效平

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 南充 637000;2.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637000)

綠原酸具有利膽、抗菌、降壓、增加白細(xì)胞及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、調(diào)血脂、清除自由基等多種藥理作用，對消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病均有顯著療效[1]。杜仲葉與皮所含化學(xué)成分基本相同，且杜仲葉中綠原酸含量更高，達(dá)到干葉重的1%～5%。因此，從杜仲葉中提取綠原酸成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[2]。筆者通過預(yù)試驗(yàn)對提取方法及提取溶劑進(jìn)行了初步考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以60%乙醇液回流提取和60%乙醇液超聲提取綠原酸提取率最高，但60%乙醇液回流法提取雜質(zhì)多，不易過濾，且溫度高，加熱時間長，易使綠原酸氧化分解。水回流提取法的不足之處在于提取溫度比醇提法更高，過濾分離困難，綠原酸含量也比醇提法偏低。采用超聲法提取，與熱回流法相比，所需溫度低、時間短，節(jié)省能源，并可提高綠原酸的穩(wěn)定性。

1 儀器與試藥

752型紫外分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);760CRT型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);TG328A型光學(xué)讀數(shù)分析天平(湘儀天平儀器廠);KQ3200DE型超聲波提取器(昆山超聲儀器有限公司);SHZ－D型循環(huán)水式真空泵(鞏義英峪予華儀器廠);RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。杜仲葉(購自重慶醫(yī)藥公司，產(chǎn)地貴州，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥教研室李生茂博士鑒定為杜仲科植物杜仲的樹葉);綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為0753－200111);硝酸鈉(AR，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司);鎢酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(分析純，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司);95%乙醇(醫(yī)用級，四川金山制藥有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 杜仲葉綠原酸含量測定[3]

2.1.1 溶液制備

稱取干燥至恒重的綠原酸對照品25mg，精密稱定，用pH=6的磷酸鹽緩沖液溶解，定容于50mL棕色容量瓶中，精密量取上述溶液12.5mL，置50mL棕色容量瓶中，以pH=6的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.134mg/mL的對照品溶液，避光低溫保存。杜仲葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過20目篩備用;稱取20 g藥材粉末，加60%乙醇(固液比1∶12)超聲提取3次，每次40min。合并提取液，真空抽濾，即得供試品溶液。

2.1.2 測定波長選擇

精密量取對照品溶液0.6mL，置10mL容量瓶中，加入配制好的硝酸鈉(1mol/L)溶液、鎢酸鈉(0.1mol/L)溶液各1mL，搖勻，用pH=6的磷酸鹽緩沖液定容，顯色30min。以相應(yīng)質(zhì)量濃度對照品溶液的磷酸鹽緩沖液稀釋液作為參比，在200～500 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見圖1。對硝酸鈉與鎢酸鈉混合液進(jìn)行掃描，光譜圖見圖2。結(jié)果顯示，綠原酸在硝酸鈉存在的條件下與鎢酸鈉反應(yīng)后在367 nm波長處出現(xiàn)最大吸收，硝酸鈉與鎢酸鈉混合液在此處無吸收，不干擾測定。故選擇367 nm為測定波長。

圖1 綠原酸與鎢酸鈉反應(yīng)后差示光譜圖

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取對照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL 各 2 份，其中1份置10mL容量瓶中，直接用pH=6的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，作為參比液;另1份加入1mol/L硝酸鈉溶液，0.1mol/L鎢酸鈉溶液各1mL，再以pH=6的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為樣品溶液。將以上配得的系列標(biāo)準(zhǔn)供試品溶液，顯色30min后，前1份置參比池，后1份置樣品池，在367 nm波長處測定吸光度差值ΔA。以吸光度差值(ΔA)對檢測濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 ΔA=0.031 6C －0.004 2(r=0.999 7)。結(jié)果表明，綠原酸質(zhì)量濃度在1.34～10.72μg/mL范圍內(nèi)與吸光度差值(ΔA)呈良好線性關(guān)系。

2.1.4 回收率試驗(yàn)

精密量取藥材提取液0.15mL，置3個10 mL容量瓶中，分別加入 0.4，0.2，0.05mL 對照品溶液，然后加入配制好的硝酸鈉溶液、鎢酸鈉溶液各1 mL，用pH=6的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為系列樣品溶液。同法各制作3份，按2.1.3項(xiàng)下方法測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

圖2 硝酸鈉與鎢酸鈉混合液光譜圖

表1 綠原酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.1.5 樣品含量測定

精密量取供試品溶液0.5mL，共10份，分別置10mL容量瓶中，按2.1.3項(xiàng)下方法分別測定吸光度差值(ΔA)，根據(jù)回歸方程計算提取液中綠原酸的含量。

2.2 超聲提取工藝考察

2.2.1 單因素試驗(yàn)

浸泡時間:稱取20 g杜仲葉粉末6份，加60%乙醇(固液比為 1 ∶10)分別浸泡 0，2，4，6，8，10 h后，于 40 ℃ 超聲提取 3 次，每次40 min。各自合并提取液，真空抽濾，依法測吸光度。計算綠原酸提取率，綠原酸提取率(%)=提取液中綠原酸總量/所用原料總量×100%。結(jié)果見圖3A，隨著浸泡時間延長，綠原酸提取率反而降低，故提取時藥材以不浸泡為宜。

乙醇體積分?jǐn)?shù):改變乙醇體積分?jǐn)?shù)，各組分別加入20%，40%，60%，80%，95%乙醇，固定其他條件不變。結(jié)果，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，綠原酸的提取率逐步升高，60%乙醇時綠原酸提取率最高;隨后，綠原酸的提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加反而降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%時，綠原酸的溶出明顯受到抑制(見圖 3B)。

固液比:各組分別用 60% 乙醇 1 ∶6，1 ∶8，1 ∶10，1 ∶12，1 ∶14體積比提取，固定其他條件。結(jié)果見圖3C，隨著溶劑量的增加，綠原酸提取率逐漸增高，當(dāng)固液比在1∶10以上時，固液比繼續(xù)增加對綠原酸提取率影響不大。從節(jié)約溶劑用量角度考慮，選擇1∶10為最佳提取固液比。

提取次數(shù):固定其他條件，改變提取次數(shù)。結(jié)果見圖3D，隨著提取次數(shù)的增加，綠原酸的提取率逐漸增高，提取3次后杜仲葉中的活性物質(zhì)已基本提取完全，增加提取次數(shù)，含量無顯著增加。反復(fù)多次提取有利于植物體內(nèi)天然產(chǎn)物的提取，但從工作量、生產(chǎn)成本等多種因素考慮，選擇提取次數(shù)為3次較合理。

超聲時間:固定其他條件，改變提取時間為每次20，30，40，50，60，70min，計算綠原酸提取率。結(jié)果見圖3E，隨著提取時間的增加，綠原酸的提取率增加，超聲提取50min后綠原酸得率不再增加，反而由于長時間受熱，部分綠原酸會被分解、破壞，長時間提取，含量有所下降。

提取溫度:改變超聲提取溫度，其他條件不變。結(jié)果見圖3F，隨著溫度的升高，綠原酸的提取率呈增加趨勢，同時雜質(zhì)溶出量也相應(yīng)增大，活性成分易被破壞。鑒于活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性及雜質(zhì)的溶出問題，本試驗(yàn)選擇溫度范圍為50℃左右。

圖3 單因素試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.2.2 超聲提取工藝參數(shù)優(yōu)化

在單因素考察基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、固液比(B)、提取次數(shù)(C)、超聲提取時間(D)為考察因素，以綠原酸的提取率為指標(biāo)，優(yōu)選杜仲葉中綠原酸的提取工藝。結(jié)果見表2至表4。由表3和表4可知，4個因素對綠原酸提取率的影響趨勢與單因素考察結(jié)果基本一致，因素影響的大小為提取次數(shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞固液比＞提取時間，就綠原酸提取率而言，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取次數(shù)為顯著性影響，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果、方差分析結(jié)果確定最佳工藝條件為A2B2C3D2，即60%乙醇，固液比1∶10，提取3次，每次提取50min。

表2 因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為考察最佳工藝條件的重現(xiàn)性，按A2B2C3D2條件重復(fù)6次試驗(yàn)。結(jié)果綠原酸的提取率分別為 2.43% ，2.37% ，2.41% ，2.44% ，2.35% ，2.40%，平均 2.40% ，RSD=3.7%(n=6)，表明優(yōu)選的工藝合理、可行。

3 討論

超聲波提取是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運(yùn)動速度，增大介質(zhì)的穿透力以提取中藥有效成分的方法。超聲提取所需溫度低，避免了中藥常規(guī)煎煮法、回流法長時間加熱對有效成分的不良影響，同時也節(jié)約了能源。

通過單因素及正交試驗(yàn)結(jié)果分析，超聲提取杜仲葉中綠原酸的最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，固液比1∶10，提取次數(shù)3次，提取時間50min。工藝驗(yàn)證結(jié)果顯示，優(yōu)選的工藝合理、可行，可用于杜仲葉綠原酸的提取。

表4 方差分析結(jié)果

[1]劉軍海，任惠蘭，裘愛泳.杜仲葉中綠原酸的提取研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19(5):1 184－1 186.

[2]張凌裳，王紅連，杜郭君，等.杜仲葉粉提取綠原酸工藝的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(17):8 162 －8 164.

[3]王柏強(qiáng).差示分光光度法測定杜仲葉提取液中綠原酸的含量[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，23(5):461－463.