不同倍性菘藍(lán)幼苗對(duì)鹽漬脅迫的耐受能力及保護(hù)性酶的響應(yīng)機(jī)制

王麗艷，荊瑞勇，郭永霞，殷奎德

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶163319）

菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort.）為十字花科菘藍(lán)屬兩年生草本植物，以干燥根及葉入藥，分別稱板藍(lán)根和大青葉，為常用中藥材［1］。有關(guān)菘藍(lán)二倍體和四倍體的比較研究中，有從生藥學(xué)角度研究根中靛藍(lán)、靛玉紅、總氨基酸含量的，結(jié)果表明，四倍體較二倍體均有明顯提高［2］，菘藍(lán)根中四倍體游離氨基酸和水解氨基酸的含量均高于二倍體［3］；遺傳特性方面的比較研究表明，菘藍(lán)二倍體與其同源四倍體具有中等偏高的遺傳差異性［4］；在生理方面對(duì)菘藍(lán)體內(nèi)超氧化物歧化酶的活性研究結(jié)果表明，四倍體的酶活性比二倍體的高［5］。有關(guān)二倍體和四倍體在耐鹽性方面的比較研究目前還未見報(bào)道。

黑龍江大慶市大同區(qū)是板藍(lán)根的主產(chǎn)區(qū)之一，也是最大的產(chǎn)區(qū)，大慶板藍(lán)根種植面積約為全國(guó)的2／3，平常年份板藍(lán)根的年產(chǎn)量約在2.5萬(wàn)t左右。所產(chǎn)板藍(lán)根品質(zhì)上乘，目前種植的菘藍(lán)主要為二倍體品種。大慶地區(qū)有大面積的鹽堿地區(qū)，如能推廣種植菘藍(lán)也是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。另外板藍(lán)根的主要藥效成分為次生代謝產(chǎn)物，逆境條件下可能會(huì)增加其藥效成分，根據(jù)前人在生藥學(xué)方面的研究，四倍體較二倍體優(yōu)越很多［2－3］，因此本試驗(yàn)對(duì)二倍體和四倍體在耐鹽性方面進(jìn)行比較分析，為不同倍性菘藍(lán)種植區(qū)域的選擇，同時(shí)也為四倍體菘藍(lán)能否在大慶鹽堿地區(qū)推廣種植提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為二倍體和四倍體菘藍(lán)，購(gòu)于毫州市春秋藥材種業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 鹽脅迫處理方法

采用在MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的Na Cl模擬鹽脅迫。MS培養(yǎng)基中附加30 g／L蔗糖、8 g／L植物瓊脂，p H 值5.7，分別附加濃度為0，50，100，150，200，250，300 mmol／L的 NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理，以Na Cl濃度為0的作為對(duì)照。

將二倍體和四倍體菘藍(lán)種子去除種皮后用75%的乙醇處理5 min，再用0.1%的升汞處理10 min，用無(wú)菌水沖洗4～5遍，然后接種于上述不同處理的培養(yǎng)基中，本試驗(yàn)共設(shè)7（鹽濃度）×2（倍性）＝14個(gè)處理，每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)5瓶，每瓶20粒。置于溫度為（25±2）℃的組織培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，前三天進(jìn)行暗培養(yǎng)，然后于光強(qiáng)1 500～2 000 l x，每日光照時(shí)數(shù)14 h的光照下培養(yǎng)7 d，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。培養(yǎng)到第10天時(shí)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

1.3.1 發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)的測(cè)定

種子發(fā)芽率＝種子正常發(fā)芽粒數(shù)／供試種子數(shù)×100%；

種子發(fā)芽勢(shì)＝種子第4天正常發(fā)芽粒數(shù)／供試種子粒數(shù)×100%；

種子發(fā)芽指數(shù)＝∑Gt／Dt

式中：Gt——Dt相對(duì)應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)；Dt——發(fā)芽時(shí)間。

1.3.2 株高、根長(zhǎng)、幼苗鮮重、根冠比的測(cè)定 當(dāng)種

子接入培養(yǎng)基10 d后進(jìn)行芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根重、芽重和根冠比測(cè)定。

1.3.3 丙二醛和脯氨酸含量的測(cè)定 將種子接種到培養(yǎng)基中10 d后，采樣測(cè)定植株莖葉中的丙二醛和脯氨酸的含量：丙二醛含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法［6］；脯氨酸含量的測(cè)定采用磺基水楊酸比色法［6］。

1.3.4 保護(hù)性酶SOD、POD、CAT活性測(cè)定 超氧化物歧化酶（SOD）采用氮藍(lán)四唑（NBT）法進(jìn)行測(cè)定［6］；過(guò)氧化物酶（POD）采用愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行測(cè)定，以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）［6］；過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性測(cè)定采用紫外吸收法進(jìn)行測(cè)定，以每分鐘內(nèi)A240下降0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（U）［7］。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用統(tǒng)計(jì)軟件Excel和SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫處理對(duì)不同倍性菘藍(lán)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)的影響

2.1.1 鹽脅迫處理對(duì)不同倍性菘藍(lán)發(fā)芽率的影響

將菘藍(lán)種子接種于不同處理的培養(yǎng)基中后，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，采用多重比較中的最小顯著差法（LSD）進(jìn)行方差分析，結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，隨著

NaCl濃度的增加，二倍體和四倍體菘藍(lán)發(fā)芽率均呈下降的趨勢(shì)。當(dāng)NaCl濃度為0～150 mmol／L時(shí)，到第5天時(shí)發(fā)芽率基本達(dá)到最大值，而Na Cl濃度＞

150 mmol／L時(shí)，到第6天時(shí)發(fā)芽率達(dá)到最大值；從二倍體和四倍體的差異來(lái)看，二倍體對(duì)照和Na Cl濃度為50 mmol／L時(shí)第7天的發(fā)芽率達(dá)96%，而當(dāng)

NaCl濃度為100 mmol／L和150 mmol／L時(shí)，其發(fā)芽率分別為77%和73%，從方差分析來(lái)看其與對(duì)照和

NaCl濃度為50 mmol／L的發(fā)芽率差異達(dá)到顯著性水平，而四倍體對(duì)照第7天的發(fā)芽率達(dá)99%，當(dāng)Na Cl

濃度為50、100 mmol／L和150 mmol／L時(shí)，第7天的發(fā)芽率均達(dá)到90%以上分別為92%，90%和90%。

通過(guò)顯著性分析可知，兩個(gè)倍性菘藍(lán)品種第7天發(fā)芽率的差異表現(xiàn)為：在Na Cl濃度為100、150 mmol／L

和200 mmol／L時(shí)，四倍體的發(fā)芽率顯著高于二倍體，其他濃度下差異不顯著。因此，從發(fā)芽率來(lái)看，四倍體菘藍(lán)較二倍體菘藍(lán)耐鹽脅迫能力強(qiáng)。

2.1.2 鹽脅迫處理對(duì)不同倍性菘藍(lán)發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的影響 種子在失去發(fā)芽力之前，已發(fā)生了劣變，

可從發(fā)芽勢(shì)或發(fā)芽指數(shù)反映出來(lái)，故二者比發(fā)芽率更能靈敏地表現(xiàn)種子活力。

圖1 不同濃度NaCl處理下菘藍(lán)的發(fā)芽率

總體來(lái)看，二倍體和四倍體菘藍(lán)的發(fā)芽勢(shì)均隨NaCl濃度的增加呈逐漸下降的趨勢(shì)，從方差分析可以看出，二倍體菘藍(lán)的發(fā)芽勢(shì)在各Na Cl濃度之間的差異均達(dá)到顯著水平，而四倍體在NaCl濃度為100 mmol／L和150 mmol／L時(shí)發(fā)芽勢(shì)之間無(wú)顯著性差異，并且在此濃度下四倍體較二倍體的發(fā)芽勢(shì)要高；二倍體和四倍體菘藍(lán)的發(fā)芽指數(shù)均隨著Na Cl濃度的增加而呈逐漸下降的趨勢(shì)，

圖2 不同濃度NaCl處理下菘藍(lán)的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)

從方差分析可以看出，二倍體和四倍體菘藍(lán)的發(fā)芽指數(shù)在各Na Cl濃度之間的差異均達(dá)到顯著水平。但四倍體較二倍體下降的趨勢(shì)要緩和，Na Cl濃度為50 mmol／L時(shí)，二倍體的發(fā)芽指數(shù)要高于四倍體，隨著NaCl濃度的增加，當(dāng)濃度為100～250 mmol／L時(shí)，四倍體要高于二倍體，尤其是NaCl濃度為150 mmol／L時(shí)，四倍體較二倍體要高得多。從兩個(gè)倍性菘藍(lán)品種發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的差異顯著性分析可知，當(dāng)Na Cl濃度為50 mmol／L時(shí)，二倍體菘藍(lán)的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)顯著高于四倍體菘藍(lán)，而當(dāng)Na Cl濃度為150 mmol／L時(shí)四倍體菘藍(lán)又顯著高于二倍體菘藍(lán)，其他濃度下二倍體和四倍體間的差異不顯著（圖2）。因此發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均可以說(shuō)明，四倍體菘藍(lán)較二倍體菘藍(lán)的耐鹽脅迫能力強(qiáng)。

2.2 鹽脅迫處理對(duì)不同倍性菘藍(lán)芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根重、芽重和根冠比的影響

當(dāng)種子接入培養(yǎng)基10 d后，將組培苗取出，進(jìn)行根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根重、芽重的測(cè)定，進(jìn)一步計(jì)算出根冠比，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3所示。由于當(dāng)Na Cl濃度大于200 mmol／L時(shí)，在種子接種10 d后，僅有芽發(fā)出而未能形成植株，因此此部分未對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

從圖3中可以看出，總體來(lái)看，二倍體菘藍(lán)的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根重、芽重均隨著NaCl濃度的增加呈逐漸下降的趨勢(shì)，且根長(zhǎng)和根重的降低幅度明顯大于芽長(zhǎng)和芽重；而四倍體菘藍(lán)的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根重、芽重均隨著Na Cl濃度的增加呈先增加后下降的趨勢(shì)。二倍體對(duì)照的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根重、芽重均高于四倍體對(duì)照，而隨著Na Cl的加入，四倍體又均高于二倍體。說(shuō)明鹽脅迫對(duì)二倍體的影響較四倍體大，四倍體較二倍體耐鹽脅迫能力強(qiáng)。二倍體菘藍(lán)根冠比呈逐漸下降的趨勢(shì)，四倍體菘藍(lán)呈逐漸增加的趨勢(shì)。從方差分析可以看出，二倍體菘藍(lán)在Na Cl濃度＞100 mmol／L時(shí)根冠比無(wú)差異，四倍體菘藍(lán)在＞150 mmol／L時(shí)根冠比無(wú)差異。當(dāng) Na Cl濃度為50，100，150，200 mmol／L時(shí)，四倍體的根冠比分別為二倍體的1.67，2.46，3.24，3.29倍。對(duì)二倍體和四倍體菘藍(lán)上述指標(biāo)的方差分析可知，對(duì)照組的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)二倍體菘藍(lán)顯著高于四倍體菘藍(lán)，根重、芽重和根冠比差異不顯著；當(dāng)有NaCl加入時(shí)，四倍體菘藍(lán)的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根重、芽重和根冠比顯著高于二倍體菘藍(lán)。

2.3 鹽脅迫處理對(duì)不同倍性菘藍(lán)丙二醛和脯氨酸含量的影響

丙二醛是膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受傷害的重要標(biāo)志之一，其含量可以表示膜脂過(guò)氧化作用的程度［8］。不同濃度NaCl處理下不同倍性菘藍(lán)中丙二醛含量的測(cè)定結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，二倍體和四倍體菘藍(lán)隨著Na Cl濃度的增加，丙二醛含量呈現(xiàn)先稍降低后增加的趨勢(shì)，在濃度為50 mmol／L時(shí)最低。從方差分析可以看出，NaCl濃度為0與50 mmol／L之間時(shí)，二者丙二醛含量的差異不顯著，但與其它濃度之間差異均達(dá)顯著性水平，說(shuō)明Na Cl濃度為50 mmol／L時(shí)，膜系統(tǒng)基本沒有受到損傷，但隨著NaCl濃度的增加，膜系統(tǒng)受損程度逐漸加重。從圖4中還可以看出，各濃度下二倍體菘藍(lán)丙二醛含量均高于四倍體菘藍(lán)。當(dāng)NaCl濃度為200 mmol／L時(shí)，丙二醛含量較對(duì)照二倍體增加了2.64倍，四倍體增加了2.3倍。從二倍體菘藍(lán)和四倍體菘藍(lán)丙二醛含量的差異性分析可知，對(duì)照組和Na Cl濃度為50 mmol／L時(shí)，二倍體與四倍體之間的差異不顯著，當(dāng)Na Cl濃度＞50 mmol／L時(shí)，二倍體的丙二醛含量顯著高于四倍體。這在一定程度上說(shuō)明隨著Na Cl濃度的增加，四倍體菘藍(lán)的膜系統(tǒng)受損傷程度低于二倍體菘藍(lán)。這在一定程度上說(shuō)明四倍體菘藍(lán)較二倍體菘藍(lán)的耐鹽脅迫能力強(qiáng)。

脯氨酸是植物細(xì)胞質(zhì)中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)［9］。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸［6］，在逆境條件下，植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加。不同濃度NaCl處理下不同倍性菘藍(lán)中脯氨酸含量的測(cè)定結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，隨著Na Cl濃度的增加，二倍體和四倍體菘藍(lán)脯氨酸含量呈逐漸增加的趨勢(shì)。從方差分析可以看出，各Na Cl濃度之間脯氨酸含量差異均達(dá)到顯著性水平。在NaCl濃度較低（0～100 mmol／L）時(shí)二倍體脯氨酸增加量較四倍體明顯，在 NaCl濃度較高（150～200 mmol／L）時(shí)四倍體脯氨酸增加量較二倍體明顯。從二倍體菘藍(lán)和四倍體菘藍(lán)脯氨酸含量的差異性分析可知，NaCl濃度為50 mmol／L時(shí)，二倍體顯著高于四倍體，當(dāng)Na Cl濃度為200 mmol／L時(shí)，四倍體顯著高于二倍體，其他濃度下二倍體和四倍體脯氨酸含量差異不顯著。這也在一定程度上說(shuō)明四倍體菘藍(lán)較二倍體菘藍(lán)耐鹽脅迫能力強(qiáng)。

圖3 不同濃度NaCl處理下菘藍(lán)的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根重、芽重和根冠比變化

2.4 鹽脅迫處理對(duì)不同倍性菘藍(lán)保護(hù)性酶SOD、POD、CAT活性的影響

在鹽脅迫下，菘藍(lán)體內(nèi)活性氧代謝失調(diào)，此時(shí)由SOD、POD、CAT等內(nèi)源活性氧清除劑構(gòu)成的酶保護(hù)系統(tǒng)被激活，其活性增加以清除活性氧，以此來(lái)緩解鹽脅迫對(duì)菘藍(lán)造成的傷害。由圖5可見，隨著Na Cl濃度的增加，二倍體和四倍體菘藍(lán)中SOD、POD和CAT三種保護(hù)性酶均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。酶活性之所以降低是因?yàn)楫?dāng)鹽濃度增大后，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生能力大于清除能力時(shí)，過(guò)量的活性氧就破壞或降低了保護(hù)性酶的結(jié)構(gòu)或活性［10］。其中SOD和CAT的增加趨勢(shì)一致，當(dāng)Na Cl濃度為50 mmol／L時(shí)菘藍(lán)體內(nèi)酶活性最大。而POD當(dāng)Na Cl濃度為100 mmol／L時(shí)的酶活性最大，這說(shuō)明在不同NaCl濃度下，起主要保護(hù)作用的酶是不同的。從不同倍性菘藍(lán)來(lái)看，當(dāng)Na Cl濃度從0增加到200 mmol／L時(shí)，四倍體的SOD、POD和CAT三種保護(hù)性酶活性均高于二倍體。方差分析可知，POD活性在對(duì)照組和Na Cl濃度為200 mmol／L時(shí)，二倍體菘藍(lán)與四倍體菘藍(lán)間的差異不顯著，當(dāng)NaCl濃度為50，100和200 mmol／L時(shí)，四倍體菘藍(lán)POD活性顯著高于二倍體；SOD活性在Na Cl濃度為100 mmol／L和150 mmol／L時(shí)，四倍體顯著高于二倍體，其他濃度下二者差異不顯著；CAT活性在對(duì)照組二倍體與四倍體間的差異不顯著，有Na Cl加入時(shí)，四倍體CAT活性均顯著高于二倍體。這說(shuō)明在鹽脅迫下四倍體菘藍(lán)對(duì)活性氧的清除能力要高于二倍體菘藍(lán)。

圖4 不同濃度NaCl處理下菘藍(lán)的丙二醛和脯氨酸含量

圖5 不同濃度NaCl處理下菘藍(lán)的SOD、POD、CAT活性

3 結(jié)論與討論

種子萌發(fā)是植物體生活史中重要的階段，直接影響到植物體后期的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成，從而會(huì)間接影響產(chǎn)量的形成，因此種子能夠迅速整齊的萌發(fā)，是獲得高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的基礎(chǔ)［11］。鹽脅迫與干旱脅迫不同，鹽脅迫在植物的整個(gè)生活史中都會(huì)起作用，而干旱與灌溉量或降雨量有關(guān)，屬于階段性脅迫，因此對(duì)鹽脅迫來(lái)說(shuō)，種子萌發(fā)階段顯得更加重要。本試驗(yàn)結(jié)果無(wú)論從發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)還是發(fā)芽指數(shù)方面的結(jié)果均說(shuō)明四倍體較二倍體均具有更好的耐鹽脅迫能力。

鹽脅迫對(duì)植物最普遍、最顯著的影響就是抑制生長(zhǎng)。生長(zhǎng)特性是植物對(duì)鹽脅迫的綜合反應(yīng)，也是植物耐鹽性的最優(yōu)評(píng)價(jià)指標(biāo)［12］。種子植物苗期是生活史中最為脆弱的階段，本試驗(yàn)對(duì)菘藍(lán)苗期生長(zhǎng)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，當(dāng)Na Cl濃度為0時(shí)，二倍體的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根重、芽重均高于四倍體，而隨著Na Cl的加入，四倍體又均高于二倍體。根冠比表現(xiàn)為二倍體隨著NaCl濃度的增加而降低，而四倍體正好相反，隨著Na Cl濃度的增加而增加，說(shuō)明四倍體較二倍體耐鹽脅迫能力強(qiáng)。

植物在逆境條件下，往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，丙二醛是其產(chǎn)物之一，因此其可以表示植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱以及膜系統(tǒng)受損傷的程度，植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗逆性強(qiáng)的品種往往會(huì)積累較多的脯氨酸。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl濃度的增加，二倍體和四倍體中丙二醛含量均呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，膜系統(tǒng)受損程度越發(fā)加重，但四倍體中丙二醛含量始終低于二倍體，由此說(shuō)明隨著Na Cl濃度的增加，四倍體菘藍(lán)的膜系統(tǒng)受損傷程度低于二倍體菘藍(lán)，四倍體菘藍(lán)較二倍體菘藍(lán)的耐鹽脅迫能力強(qiáng)；在Na Cl濃度較低時(shí)，二倍體脯氨酸增加量較四倍體明顯，在NaCl濃度較高時(shí)，四倍體脯氨酸增加量較二倍體明顯。這也在一定程度上說(shuō)明四倍體菘藍(lán)較二倍體菘藍(lán)的耐鹽脅迫能力強(qiáng)。

植物體內(nèi)始終存在著活性氧產(chǎn)生與清除兩個(gè)過(guò)程，正常情況下兩個(gè)過(guò)程處于平衡狀態(tài)，而當(dāng)植物遭受逆境時(shí)，植物體內(nèi)活性氧代謝的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，產(chǎn)生大量的活性氧自由基破壞植物細(xì)胞膜［13］。SOD是一切需氧有機(jī)體中普遍存在的一種起保護(hù)作用的酶，在植物抵抗鹽害的過(guò)程中起防止、中斷膜脂過(guò)氧化、保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)不受損傷的作用，其酶活力與植物抗逆性關(guān)系密切［14］。POD在植物體內(nèi)具有廣泛的作用［15］，其主要作用之一是是分解由SOD產(chǎn)生的H2O2，進(jìn)一步形成H2O和O2［16－17］。CAT 可 以 直 接將H2O2分解為H2O和O2，不需要還原力而具有較高的反應(yīng)速率［18］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同NaCl濃度下，起主要保護(hù)作用的酶是不同的，無(wú)論有無(wú)鹽脅迫、Na Cl濃度高低，四倍體中的SOD、POD和CAT三種保護(hù)性酶活性均高于二倍體。這說(shuō)明在鹽脅迫下四倍體菘藍(lán)對(duì)活性氧的清除能力要高于二倍體菘藍(lán)，因此部分解釋了四倍體菘藍(lán)的耐鹽脅迫能力要高于二倍體。

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