肝素對金黃色葡萄球菌與血漿蛋白間粘附的阻斷作用

鄭 勝，張月明，鄒姍姍，錢院紅，舒?zhèn)鳂I(yè)，易 景，唐同同，張羽汐

(東北電力大學化學工程學院，吉林 吉林 132012)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，金葡菌)是人和動物化膿感染中最常見的病原菌，可引起一系列不同程度的感染。一個不太嚴重的傷口若感染金黃色葡萄球菌，則極有可能發(fā)展為惡性的敗血癥、骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎或心內(nèi)膜炎等[1]。金黃色葡萄球菌更是醫(yī)院感染中最常見的病原菌之一。據(jù)估計，約有0.5% ～1.5%的器官移植病人會受此菌感染，在某些情況下這個比率甚至會更高[2]。近年來，報告金黃色葡萄球菌感染的病例不斷增加，在世界范圍內(nèi)，葡萄球菌株的耐藥性日趨嚴重，給治療帶來一定的困難，因而當前迫切需要尋求新的抗生素以防治金黃色葡萄球菌[3]。

金黃色葡萄球菌通過表面的粘附素與宿主的細胞外基質(zhì)發(fā)生特定的相互作用，是其感染的先決條件。若能阻斷粘附環(huán)節(jié)，細菌將無法定居和繁殖，從而不能產(chǎn)生和釋放胞外酶和外毒素，即可降低由其引發(fā)的疾病的發(fā)病率[4]。本研究的目的是通過靜止粘附技術(shù)的實驗手段，研究肝素對金黃色葡萄球菌與血漿蛋白粘附作用的阻斷，以及肝素對淋巴細胞吞噬作用的影響。以期尋找防治金黃色葡萄球菌感染的新途徑，為抗金黃色葡萄球菌感染藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及血漿蛋白和淋巴細胞的分離

1.1.1 血漿蛋白的分離

取ICR小鼠(購自吉林大學動物中心)，麻醉后采用眼眶采血法取血3 mL，按71的比例加入檸檬酸抗凝劑，混合均勻后置于離心機中，以1500 rpm的轉(zhuǎn)速離心20 min，離心后將上層血清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 淋巴細胞的分離

將八層紗布置于培養(yǎng)皿中，用PBS充分浸潤，取小鼠脾臟用紗布包好后將其充分搗碎。取出紗布瀝干，將培養(yǎng)皿中的液體轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，以1500 rpm的轉(zhuǎn)速離心10 min。離心后棄上清液，用適量PBS將沉淀重懸，再以1500 rpm的轉(zhuǎn)速離心10 min，如此反復兩次。最后將沉淀的淋巴細胞以適量PBS重懸，重懸均勻后分裝至幾只干凈的離心管中，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆眉纯伞?/p>

1.2 金黃色葡萄球菌菌液的制備

取金黃色葡萄球菌菌株斜面培養(yǎng)物接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃、1500 rpm振蕩培養(yǎng)3～4 h。3～4 h后，采用顯微鏡直接計數(shù)法對菌液進行計數(shù)，將菌液濃度調(diào)整至(10～100)×104個/ml，即血細胞計數(shù)板上平均每一大格的菌落數(shù)目為10～100個。置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肝素對粘附作用的阻斷及最適作用濃度的確定

(1)取16只載玻片，任取其中2只編號①，各滴加30 μLPBS做空白對照;其余14只隨機分成7組，編號②～⑧，分別滴加30 μL血漿蛋白溶液，滴好后置于4℃冰箱中過夜粘附;

(2)次日，取適量金黃色葡萄球菌菌液分別與 PBS、1.0、0.9、0.7、0.5、0.3、0.1 mg/mL 肝素溶液按91的比例混合，分別編號菌液A－G，混合均勻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min;

(3)30 min后從4℃冰箱中取出載玻片，用濾紙吸去未粘附在載玻片上的PBS和血漿蛋白溶液，①～②號滴加足量的菌液A，③－⑧依次滴加足量的菌液B－G，使菌液充分覆蓋住載玻片上殘留的PBS和血漿蛋白溶液。將全部載玻片重新移至37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min;

(4)30 min后將試樣全部取出，用PBS將載玻片上的未粘附菌沖掉，鏡檢計數(shù)。粘附固定的菌落數(shù)目越少，說明阻斷作用越明顯。

1.4 肝素對淋巴細胞吞噬作用的影響

(1)取4只干凈的離心管，編號①～④，分別滴加50 μL金黃色葡萄球菌菌液。其中①～③繼續(xù)滴加50 μLPBS，④號滴加50 μL 1 mg/mL的肝素溶液，混合均勻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min;

(2)30 min后取出，①～②號滴加50 μLPBS，③～④號滴加50 μL血漿蛋白溶液，混合均勻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min;

(3)30 min后，①號滴加50 μLPBS，②～④號滴加50 μL淋巴細胞溶液，混合均勻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。之后每隔1 h取出鏡檢計數(shù)一次，共計孵育4 h，鏡檢計數(shù)4次，觀察淋巴細胞對金黃色葡萄球菌的吞噬及肝素對這種吞噬作用的影響。

2 實驗結(jié)果

2.1 肝素阻斷粘附作用的最適濃度的確定

本文采用靜止粘附實驗檢驗肝素對金黃色葡萄球菌與血漿蛋白間粘附的阻斷作用，在預先鋪好血漿蛋白的玻片上加入用不同濃度肝素或PBS孵育后的金黃色葡萄球菌，并觀察、統(tǒng)計其粘附的細胞數(shù)目。

實驗結(jié)果如圖1所示，1 mg/mL濃度的肝素溶液對粘附作用的阻斷效果最明顯，在該濃度下，粘附作用的強度最弱，固定的菌落數(shù)目最少;隨著肝素溶液濃度的降低，阻斷強度依次減弱;0.1 mg/mL濃度的肝素溶液對粘附作用的阻斷效果最微弱。

在使用時需要考慮藥品用量的問題。0.9 mg/mL、1 mg/mL濃度的肝素溶液阻斷效果最明顯，但藥品用量過大;0.5 mg/mL和0.7 mg/mL的肝素溶液對粘附作用的阻斷程度接近，且均有較為明顯的現(xiàn)象。因此，建議確定肝素溶液作用的使用濃度為 0.5 mg/mL。

圖1 不同濃度肝素溶液對粘附作用的阻斷

圖2 菌體固定數(shù)目隨時間變化規(guī)律

2.2 肝素對淋巴細胞吞噬作用的影響

本文采用體外吞噬實驗檢驗血漿蛋白對淋巴細胞吞噬金黃色葡萄球菌的影響，并檢驗肝素對這種影響的遏制。實驗如圖2所示，淋巴細胞對游離的金黃色葡萄球菌有明顯的吞噬作用;金黃色葡萄球菌粘附血漿蛋白后，淋巴細胞的吞噬作用減弱;添加肝素溶液后，這種吞噬作用的強度有回升的趨勢。

3 討 論

本研究主要采用靜止粘附技術(shù)的實驗手段，觀察并研究肝素對金黃色葡萄球菌粘附血漿蛋白的阻斷作用。實驗結(jié)果顯示，肝素對粘附過程有明顯的阻斷作用，且肝素溶液作用的最適濃度為0.5 mg/mL。

金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的細胞外結(jié)合基質(zhì)蛋白主要有能夠識別纖連蛋白的纖連蛋白結(jié)合蛋白FnBP、能夠識別纖維蛋白原的纖維蛋白結(jié)合蛋白ClfA/B(聚集因子A/B)，以及能夠識別膠原蛋白的膠原蛋白結(jié)合蛋白 Cna[5]。

由大量實驗及相關(guān)文獻資料可證實，幾乎所有的金黃色葡萄球菌都具有纖連蛋白結(jié)合蛋白FnBP。FnBP能夠識別機體的纖連蛋白，并與之發(fā)生特異性相互作用，依此介導金黃色葡萄球菌黏附于宿主組織[6]。肝素能夠阻斷FnBP與宿主細胞纖連蛋白之間的這種特異性相互作用，因此添加肝素溶液后粘附現(xiàn)象減弱。另外，該實驗結(jié)果還可以證明FnBP在細菌粘附宿主細胞的過程中發(fā)揮著重要的作用，是金黃色葡萄球菌重要的粘附素之一。

肝素對淋巴細胞吞噬作用的影響的研究結(jié)果顯示，淋巴細胞對游離的金黃色葡萄球菌具有明顯的吞噬作用;金黃色葡萄球菌粘附血漿蛋白后，淋巴細胞的吞噬作用減弱;加入肝素溶液后，吞噬作用的強度又有回升的趨勢。

金黃色葡萄球菌粘附血漿蛋白后，它的表面蛋白將機體細胞的可溶性細胞外基質(zhì)(如纖連蛋白、膠原蛋白、纖維蛋白原等)大量結(jié)合在細菌菌體表面，使細菌體完全被宿主的細胞外基質(zhì)包圍，從而不被宿主的免疫系統(tǒng)所識別，因此淋巴細胞對金黃色葡萄球菌的吞噬作用減弱。加入肝素后，金黃色葡萄球菌與血漿蛋白的粘附作用被阻斷，游離的金黃色葡萄球菌數(shù)目增多，被宿主細胞的細胞外基質(zhì)包被的菌體數(shù)目減少，所以淋巴細胞的吞噬作用增強。這一實驗結(jié)果也充分證明了金黃色葡萄球菌的表面蛋白除了介導細菌粘附外，還賦予細菌逃避宿主防御機制的功能[7]。

在抗生素使用如此普及的今天，金黃色葡萄球菌的耐藥性日趨嚴重，給治療帶來一定的困難。由于缺乏有效的抗菌藥物，許多病人感染高致病菌后便無藥可治[8]。因而當前迫切需要尋求新的抗生素以防治金黃色葡萄球菌，而找到針對病原菌的新的靶點是獲得新型抗生素的先決條件。金黃色葡萄球菌的表面蛋白由于具有與宿主組織特異的粘附能力，正成為抗金黃色葡萄球菌感染疫苗開發(fā)的熱點分子[9]。

因此，觀察并研究金黃色葡萄球菌的粘附現(xiàn)象，基于金黃色葡萄球菌表面蛋白的粘附機制研究如何阻斷金黃色葡萄球菌對宿主細胞的粘附和侵入，從而防治由金黃色葡萄球菌感染所引發(fā)的疾病，并開發(fā)研制新型、安全、高效的抗金黃色葡萄球菌疫苗，是研究如何防治金黃色葡萄球菌感染的一個全新角度，具有十分廣闊的研究前景[10]。

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[10]張曉艷，易紹瓊，陳薇.金黃色葡萄球菌疫苗的研究進展[J].微生物學免疫學進展，2009，37(2):74－78.