川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

陳道陽(yáng) 陳曉丹 王利勝

1.廣東省人民政府機(jī)關(guān)門(mén)診部，廣東廣州 510030；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006

川芎嗪是從中藥川芎中提取的一種主要有效成分，具有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善微循環(huán)等多種藥理活性[1]，臨床主要用于治療動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦血管病、肺動(dòng)脈高壓等疾病[2]。長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體是一種具有多功能的靶向藥物載體，其在體內(nèi)可阻止巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的識(shí)別和攝取，而極大延長(zhǎng)脂質(zhì)體在血液中的循環(huán)時(shí)間[3]。把川芎嗪制成長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體制劑，可顯著改善川芎嗪口服吸收差、生物利用度低、半衰期短、代謝快等問(wèn)題，有效提高了川芎嗪的療效。本實(shí)驗(yàn)旨在建立簡(jiǎn)單可行、穩(wěn)定可靠的分析方法，以準(zhǔn)確測(cè)定川芎嗪在制劑中的含量和包封率，為評(píng)價(jià)和控制川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：Waters515泵、2487紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；N3000色譜工作站（浙江大學(xué)）；精密分析天平AUW120D（日本島津公司）；JB-3型定時(shí)恒溫磁力攪拌器（上海雷磁新涇儀器有限公司）；微孔濾膜（德國(guó)ME MBRANA公司）。

TMP（含量>98.5%，江蘇南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；大豆卵磷脂（上海泰偉藥業(yè)）；膽固醇（上海伯奧生物科技有限公司）；PEG3000-DSPE（德國(guó)lipoid公司）；葡聚糖凝膠-G50（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體[4]采用乙醇注入法制備，精密稱取處方量的川芎嗪、卵磷脂、膽固醇和PEG3000-DSPE，加入適量的無(wú)水乙醇使之溶解。將上述乙醇溶液勻速注入到水浴60℃的PBS 6.5溶液中，恒溫快速攪拌至無(wú)醇味，靜置，過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2.1.2 空白脂質(zhì)體 按處方精密稱取卵磷脂、膽固醇、PEG 3000-DSPE等輔料，同法制備不含藥物的空白脂質(zhì)體，備用。

2.2 分析方法的建立[5]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：迪馬platisil ODS柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），Phenomenex保護(hù)柱；流動(dòng)相：甲醇-0.5%冰乙酸（40∶60）；流速：1 mL/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：298 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 專屬性試驗(yàn) 取空白脂質(zhì)體和川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體各0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇破乳并定容至刻度，搖勻，分別作為陰性溶液和樣品溶液。將陰性溶液、樣品溶液和43.60 μg/mL的川芎嗪對(duì)照品溶液分別進(jìn)行HPLC分析。色譜圖見(jiàn)圖1，川芎嗪的保留時(shí)間約為13.2 min，峰形良好，空白輔料對(duì)川芎嗪的測(cè)定無(wú)干擾。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取川芎嗪對(duì)照品8.72 mg，用甲醇配制成濃度為 1.09、2.18、5.45、10.90、21.80、43.60 μg/mL的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積A為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程：A=24 178.21C-101.40（r=0.9995），表明川芎嗪在 1.09～43.60 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取10.90 μg/mL川芎嗪對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算得到RSD為1.41%，說(shuō)明該法精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體適量，用甲醇破乳并稀釋，搖勻，于室溫放置 24 h，分別于 0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算得到RSD為1.79%，說(shuō)明樣品溶液在24 h內(nèi)基本上穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體5份，按“2.2.2”項(xiàng)下配制樣品溶液，進(jìn)行分析，結(jié)果川芎嗪質(zhì)量濃度穩(wěn)定，RSD為1.26%，符合要求。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 精密量取 2.18、10.90、43.60 μg/mL的川芎嗪對(duì)照品溶液1 mL，分別加入空白脂質(zhì)體1 mL，加甲醇破乳并定容至10 mL，配制成低、中、高3個(gè)濃度的混合溶液各5份，進(jìn)行液相色譜分析，計(jì)算回收率，分別為98.55%（RSD=1.59% ），97.64% （RSD=1.37% ），99.14% （RSD=1.78%），結(jié)果表明該分析方法的回收率符合要求。

2.3 分離方法的建立[6]

2.3.1 洗脫曲線的繪制 精密量取川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體0.25 mL，上葡聚糖凝膠-G50微型柱（15 cm×0.8 cm），以PBS 6.8為洗脫液，流速為0.5 mL/min，每毫升為1管收集洗脫液，共收集25管?？梢?jiàn)，乳白色的脂質(zhì)體富集于3～10管洗脫液中。將每管洗脫液用甲醇定容至2 mL，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，測(cè)定川芎嗪的含量。以藥物質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，收集份數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。圖2結(jié)果表明川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體于3～12 mL被洗脫出，而末包封的游離藥物于15～23 mL被全部洗脫出來(lái)，中間有3 mL間隔，確保了脂質(zhì)體與游離藥物能夠完全分離。

2.3.2 柱回收率測(cè)定 精密量取2.18、10.90、43.60 μg/mL的川芎嗪對(duì)照品溶液0.25 mL上柱，按上述條件進(jìn)行洗脫，收集15～23 mL的洗脫液，稀釋，定容，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，HPLC法分別測(cè)定藥物濃度，計(jì)算川芎嗪游離藥物的上柱洗脫回收率。結(jié)果低、中、高濃度的川芎嗪柱回收率分別為97.41% （RSD=1.24% ），99.01% （RSD=1.51% ），96.80%（RSD=1.39%），表明葡聚糖凝膠-G50對(duì)川芎嗪沒(méi)有吸附作用，在以上條件下藥物可被完全洗脫。

2.3.3 川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體包封率的測(cè)定[7]精密量取川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體混懸液0.25 mL，緩緩加于葡聚糖凝膠-G50微型柱（15 cm×0.8 cm）頂部，用 PBS 6.8以 0.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，以1 mL/管為單位收集3～12管的洗脫液，合并，加甲醇破乳并定容至18 mL，混合均勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，HPLC測(cè)定脂質(zhì)體中包封的藥量。另取川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體混懸液0.25 mL，用甲醇破乳并稀釋定容至5 mL，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)樣分析，測(cè)定的川芎嗪的含量為包封和未包封的藥物總量。按以下公式計(jì)算包封率：包封率=脂質(zhì)體中包封的藥物／藥物總量×100%。三批川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體樣品的包封率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的包封情況（%）

3 討論

3.1 測(cè)定方法的選擇

脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法有很多，在前期試驗(yàn)中曾采用超速離心法，在轉(zhuǎn)速20 000 r/min以上長(zhǎng)時(shí)間離心，但脂質(zhì)體仍難以完全沉淀分離，而且在高轉(zhuǎn)速條件下部分脂質(zhì)體可能被破壞而導(dǎo)致藥物滲漏；透析法雖能有效分離，但操作耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)[8]。相比之下，凝膠柱色譜法簡(jiǎn)單可靠，能使包封藥物和游離藥物得到較好的分離。

3.2 葡聚糖凝膠柱分離條件

本研究選用葡聚糖凝膠G-50能達(dá)到較好的分離效果。在分離過(guò)程中，色譜柱的徑高比、洗脫液的流速及上樣量均會(huì)影響脂質(zhì)體與游離藥物的分離效果[9]。宜選擇能達(dá)到最大分離程度的洗脫條件，才能保證包封率測(cè)定的準(zhǔn)確性。通過(guò)前期篩選試驗(yàn)，選擇徑高比為15 cm×0.8 cm，上樣量為0.25 mL，洗脫液為PBS 6.8，流速為0.5 mL/min的洗脫條件，能使川芎嗪長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體可與游離藥物達(dá)到最大程度分離。

3.3 流動(dòng)相的選用

本文建立了準(zhǔn)確、穩(wěn)定的液相色譜分析方法，在選擇流動(dòng)相條件時(shí)，若單純以甲醇-水作流動(dòng)相，會(huì)導(dǎo)致峰形拖尾嚴(yán)重，可能是由于川芎嗪堿性氮原子易與柱上未完全封閉的-OH產(chǎn)生氫鍵結(jié)合[10]，使其難以洗脫，造成拖尾。因此參考文獻(xiàn)[11-12]在流動(dòng)相中加入了少量冰乙酸，以調(diào)整峰形，達(dá)到了良好的效果。

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