辛伐他汀治療激素性股骨頭壞死患者的效果觀察及對循環(huán)內(nèi)皮祖細胞功能的影響

張 輝 劉俊峰 黃軍華 張平方

華北油田總醫(yī)院骨科，河北任丘 062552

股骨頭壞死是骨科較為常見的一種疾病，發(fā)病機制較為復(fù)雜。在我國由于存在廣泛的糖皮質(zhì)激素不合理應(yīng)用，激素性股骨頭壞死的發(fā)病率尤為突出。有研究顯示，在長期大劑量激素的應(yīng)用會造成股骨頭局部血管通透性改變以及血管活性物質(zhì)異常分泌，進而引起血流減緩、血管內(nèi)皮細胞損傷及微血栓形成，最終導(dǎo)致局部骨組織正常結(jié)構(gòu)的破壞，并且其范圍和嚴重程度與血管內(nèi)皮的損傷程度具有明顯的相關(guān)性[1]。而在維持血管內(nèi)皮的正常結(jié)構(gòu)和功能中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用的內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC），其數(shù)量和功能的下調(diào)參與了該疾病的進程。由于辛伐他汀能夠顯著改善EPC的功能狀態(tài)，本研究采用辛伐他汀對激素性股骨頭壞死患者進行治療，并對其循環(huán)EPC數(shù)量和功能進行了檢測，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇華北油田總醫(yī)院（以下簡稱“我院”）骨科2010年2月～2012年10月診治的激素性股骨頭壞死患者24例，隨機分為治療組及對照組，每組各12例。所有入選病例均符合股骨頭壞死診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。另選擇我院健康體檢者12例為正常組。各組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批通過，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基EGM-2（瑞士Lonza公司）；FITC標(biāo)記的血凝素（FITC-lectin，美國 Sigma公司）；DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?（DiI-acLDL，美國Molecular Probes公司）；噻唑藍（MTT，美國 Duchfo公司）；纖維連結(jié)蛋白（fibronectin，美國 Hematological Technologies公司）；淋巴細胞分離液（天津TBD公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 治療方法及療效評價 對照組患者予避免負重及相應(yīng)的功能鍛煉，并以常規(guī)劑量規(guī)律的服用腸溶性阿司匹林和地巴唑。治療組患者在此基礎(chǔ)上予口服辛伐他汀（山東羅欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20065119）進行治療，0.01 g/d，連續(xù)應(yīng)用12周。治療前后分別對兩組患者進行Harris評分以評價各組的臨床療效。

1.3.2 循環(huán)EPC體外培養(yǎng)及鑒定[3]所有患者治療前后于清晨空腹采集靜脈血20 mL，經(jīng)過密度梯度離心分離收集單個核細胞。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌離心后，以EGM-2培養(yǎng)基重懸細胞并調(diào)整密度為1×107個/mL，將其接種至包被有纖連蛋白的24孔板中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。第3天以PBS洗去未貼壁細胞，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并予隔日半量換液。第7天加入終濃度0.005 g/L的DiI-acLDL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，2%多聚甲醛固定后，加入0.005 g/L的FITC-lectin于37℃孵育1 h，PBS洗滌后于熒光顯微鏡下進行觀察熒光表達情況，雙熒光陽性的細胞被認為是EPC。

1.3.3 細胞增殖能力檢測 細胞培養(yǎng)第7天時以0.25%胰蛋白酶消化細胞制備單細胞懸液并調(diào)整密度為1×105個/mL，加入 96 孔板中（0.2 mL/孔），在 5%CO2、37℃培養(yǎng) 92 h 后加入 5 g/L 四甲基偶氮唑鹽（MTT）（20 μL/孔）。培養(yǎng) 4 h 后吸棄培養(yǎng)基，并加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）振蕩溶解后用酶標(biāo)儀檢測其570 nm處的吸光度（A值）。

1.3.4 黏附能力檢測 細胞培養(yǎng)第7天時以0.25%胰蛋白酶消化細胞制備單細胞懸液并調(diào)整密度為5×104個/mL，將其加入包被纖維連結(jié)蛋白的24孔板中（1 mL/孔），常規(guī)培養(yǎng)30 min后PBS沖洗3遍，200×相差顯微鏡下選取3個不同視野對貼壁細胞進行計數(shù)，取平均值。

1.3.5 細胞遷移能力檢測 細胞培養(yǎng)第7天時以0.25%胰蛋白酶消化細胞，用0.1%血清濃度、無細胞因子的EGM-2培養(yǎng)基調(diào)整密度為5×104個/mL，加入24孔板插入式培養(yǎng)皿（0.2 mL/孔），在24孔板中加入EGM-2完全培養(yǎng)基（0.6 mL/孔），并將插入式培養(yǎng)皿置于其中。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)皿去除內(nèi)層細胞，1%多聚甲醛固定外層細胞并行結(jié)晶紫染色，200×相差顯微鏡下選取3個不同視野對細胞進行計數(shù)，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 療效評價

治療前治療組 Harris評分為（76.32±3.97）分，對照組為（78.29±4.13）分，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.263，P＞0.05）。經(jīng)辛伐他汀治療 12周后，治療組 Harris評分[（93.47±4.06）分]較對照組[（87.63±3.59）分]有明顯的增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.427，P＜0.05）。

2.2 EPC培養(yǎng)及鑒定

外周血單個核細胞體外培養(yǎng)7 d后可以呈短梭狀的細胞生成，具有典型EPC的形態(tài)特征，并且這些細胞同時具有攝取DiI-acLDL和結(jié)合FITC-lectin的能力，經(jīng)Image J軟件進行圖像疊加后該類細胞呈現(xiàn)出雙陽性的黃色熒光（圖1）。

圖1 EPC的免疫熒光鑒定

2.3 EPC增殖能力的變化

MTT實驗顯示，正常組循環(huán)EPC在570 nm處的吸光度為（0.76±0.13），而治療組及對照組分別為（0.52±0.14）和（0.53±0.17），均低于正常組，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.73、4.95，均P＜0.01），且治療組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.34，P＞0.05）。在治療12周后，治療組患者EPC的體外增殖能力顯示，其在570 nm處的吸光度為（0.72±0.15），明顯高于對照組（0.62±0.11），二者差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.76，P＜0.01）。

2.4 EPC黏附能力的變化

正常組EPC在體外培養(yǎng)30 min后的貼壁細胞數(shù)為（13.42±3.15）個/HPF，而治療組與對照組分別為（5.93±1.67）個/HPF 和（5.67±1.58）個/HPF，均少于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.68、4.37，均 P＜0.01），且治療組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （t=0.24，P＞0.05）。在治療12周后，治療組患者EPC的體外黏附能力顯示，其貼壁細胞數(shù)為（11.93±3.45）個/HPF，明顯多于對照組[（8.51±3.63）個/HPF]，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.26，P＜0.01）。

2.5 EPC遷移能力的變化

正常組EPC在24孔插入式培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)24 h后，遷移至皿外層的細胞數(shù)量為（13.62±3.73）個/HPF，而治療組與對照組分別為（6.28±1.53）個/HPF 和（6.64±1.75）個/HPF，均少于正常組，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.32、4.66，均P＜0.01），且治療組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.22，P＞0.05）。在治療12周后，治療組患者EPC的體外遷移能力顯示，其遷移至皿外側(cè)的細胞數(shù)為 （10.56±3.09）個/HPF，明顯多于對照組[（7.48±3.13）個/HPF]，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.37，P＜0.01）。

3 討論

盡管糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用可以引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生已經(jīng)得到廣泛的認可，然而對于激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制卻尚無定論。近年來，有研究顯示，股骨頭局部毛細血管密度的增加可以顯著的降低股骨頭缺血性壞死的發(fā)生[4]，由此有學(xué)者認為，血管性因素有可能在股骨頭壞死的病理生理機制中起到了關(guān)鍵性的作用[5]。作為血管內(nèi)皮細胞前體的EPC主要定居于骨髓，僅有極少量存在于外周血中，它不僅參與了血管生成及再生，同時在特定的狀態(tài)下，可以遷移并歸巢至發(fā)生損傷的血管部位，在血管損傷后的修復(fù)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]，其數(shù)量及功能的變化對于血管相關(guān)性疾病的評估亦具有一定的價值。

相關(guān)的研究顯示，在激素的長期使用可以在體內(nèi)通過多種途徑對EPC的數(shù)量和功能產(chǎn)生影響[7]。一方面激素可以對血管內(nèi)皮產(chǎn)生的直接損傷作用，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的損傷和凋亡，另一方面激素的使用可以顯著降低體內(nèi)一氧化氮及血管內(nèi)皮生長因子等血管活性物質(zhì)合成，進而使EPC的增殖、遷移能力和血管生成能力減低[8-9]。諸多方面因素共同作用的結(jié)果將有可能導(dǎo)致在激素長期應(yīng)用過程中循環(huán)EPC數(shù)量和功能的改變，進而造成股骨頭局部由于血管數(shù)量及功能的異常而發(fā)生骨細胞的營養(yǎng)狀態(tài)受到抑制而產(chǎn)生凋亡甚至壞死。本研究對激素性股骨頭壞死患者的循環(huán)EPC包括增殖、黏附、遷移能力在內(nèi)的各項功能指標(biāo)進行了檢測。結(jié)果顯示與正常人群相比，激素性股骨頭壞死患者循環(huán)EPC的體外功能指標(biāo)存在不同程度的下調(diào)。由此推測，在激素長期大量應(yīng)用的過程中，由于其對血管內(nèi)皮細胞的損害導(dǎo)致股骨頭局部微血管內(nèi)皮細胞的壞死脫落，而在血管損傷修復(fù)中起到關(guān)鍵性作用的EPC由于多種細胞因子的分泌受到抑制而使其數(shù)量減少，且嚴重影響了其功能的有效發(fā)揮，最終使得受損的血管內(nèi)皮不能得到及時有效的修復(fù)而發(fā)生舒張功能受損，甚而造成局部微血栓的形成及血管的閉塞，從而影響股骨頭局部的正常血液供應(yīng)而導(dǎo)致骨質(zhì)的廣泛性破壞和結(jié)構(gòu)的改變。

辛伐他汀具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能、抑制平滑肌細胞增殖、抗炎、抗氧化等非調(diào)脂作用，作為臨床廣泛應(yīng)用的高效降脂藥物廣泛地應(yīng)用于多種心血管疾病。同時近年來其特有的改善EPC功能的作用也越來越受到人們的廣泛關(guān)注，研究顯示，他汀類藥物能夠促進EPC的動員、遷移及分化，有利于改善EPC的功能，促進缺血區(qū)域的血管新生[10]。并且其對激素性股骨頭壞死的臨床療效亦有報道[11]。在本研究中，利用辛伐他汀對激素性股骨頭壞死患者進行了治療，結(jié)果顯示，辛伐他汀的確對于激素性股骨頭壞死患者的臨床癥狀改善有所幫助，治療組在應(yīng)用辛伐他汀12周后其循環(huán)EPC的各項體外功能指標(biāo)均較對照組存在明顯上調(diào)，與之相應(yīng)的Harris評分也較對照組有顯著的提高。這表明辛伐他汀能夠通過改善激素性股骨頭壞死患者循環(huán)EPC的功能，發(fā)揮其對股骨頭局部微血管的修復(fù)功能，有效地改善股骨頭的局部血液供應(yīng)，從而達到對股骨頭壞死的治療作用。

[1]Seguln C，Kassis J，Busque L，et al.Non-traumatic necrosis of bone（osteonecrosis）is associated with endothelial cell activation but not thmmbophilia[J].Rheumatology（Oxford），2008，47（8）：115l-1155.

[2]ARCO （Association Research Circulation Osseous）.Committeeon Terminology and Classification[J].ARCO News，1992，（4）：41-46.

[3]Liu JF，Du ZD，Chen Z，et al.Endothelial progenitor cell downregulation in a mouse model of Kawasaki disease [J].Chin Med J，2012，125（3）：496-501.

[4]Wu X，Yang S，Duan D，et al.A combination of granulocyte colony stimulating factor and stem cell factor ameliorates stemid-associated osteonecresis in rabbits[J].J Rheumatol，2008，35（9）：224l-2248.

[5]Kerachian MA，Harvey EJ，Coumoyer D，et al.A vascular necrosis of the femorat head：vascular hypotheses [J].Endothelium， 2006，13（8）：237-244.

[6]Werner N，Kosiol S，Schiegl T，et al.Circulating endothelial progenitor cells and cardiovascular outcomes [J].N Engl J Med，2005，353（24）：999-1007.

[7]Vogt CJ，Sehmid-Sehonbein GW.Microvascular endothelial cell death and rarefaction in the glucacorticoid-induced hypertensive rat[J].Microcirculation，2001，8（4）：129-139.

[8]Li X，Jin L，Cui Q，et al.Steroid effects on osteogenesis through mesenchymal cell gene expression[J].Osteoporos Int，2005，16（3）：101-108.

[9]Akaike M，Matsumoto T.Glucocorticoid-induced reduction in NO bioavailability and vascular endothelial dysfunction[J].Clin Calcium，2007，17（8）：864-870.

[10]Deschaseaux F，Selmani Z，F(xiàn)alcoz PE，et al.Two types of circulating endathelial progenitor cells in patients receiving long term therapy by HMG-CoA reductase inhibitors[J].Eur J Pharmacol，2007，562（1-2）：111-118.

[11]劉會怡，潘昌如，潘平.辛伐他汀治療早期激素引起缺血性股骨頭壞死[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2012，18（2）：178-180.