外周血miR-29a-3p、miR-365a-3p在活動性肺結(jié)核和結(jié)核潛伏感染者中的表達

劉守江 張 帆 魏 巍 覃林珍 閆 敬 王三清 王 健

廣東省深圳市南山區(qū)慢性病防治中心結(jié)核病防治科，廣東深圳 518054

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類廣泛存在于真核細胞中，長度約20 nt的高度保守的非編碼RNA調(diào)控因子，是由全長的mRNA樣轉(zhuǎn)錄子加工而來，通過與對應(yīng)的靶mRNA的3'非翻譯區(qū)的非完全或完全配對結(jié)合，阻止其翻譯或破壞其穩(wěn)定性，實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控，越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤、糖尿病、心血管疾病、病毒感染等多種疾病中都起著重要作用，是正常和疾病狀態(tài)下基因調(diào)節(jié)的一個新的機制[1-2]。近年miRNA在肺結(jié)核患者中表達也是研究熱點之一。本研究主要探討miR-29a-3p、miR-365a-3p分子在活動性肺結(jié)核（TB）和結(jié)核潛伏感染（LTBI）者外周血中的表達情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集深圳市南山區(qū)慢性病防治院（以下簡稱“我院”）結(jié)核病防治科門診2012年1～10月診治的TB患者30例，其中男 17例，女 13例，平均年齡（26.1±10.1）歲，診斷標準：經(jīng)痰抗酸桿菌涂片陽性，臨床癥狀結(jié)合X線表現(xiàn)、CT診斷以及病原學(xué)檢查，符合全國結(jié)核病分類與診斷標準；LTBI者 30例，其中男 14例，女16例，平均年齡（28.9±9.5）歲，判定標準：采用結(jié)核菌特異性酶聯(lián)免疫斑點試驗陽性，而胸片未見異常[3]。兩組研究對象之間的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。所有研究對象均排除HBV、HCV、HIV病毒感染及其他慢性疾病如高血壓、糖尿病、腎炎、自身免疫性疾病等。所有研究對象均經(jīng)我院倫理委員會批準通過，并簽署知情同意書。

1.2 標本的收集和處理

抽取外周靜脈血2 mL，30 min內(nèi)分裝200 μL全血于凍存管中（已預(yù)裝有Trizol和研磨珠），振蕩混勻后-80℃保存；根據(jù)Trizol Reagent試劑盒說明書（Invitrogen）抽提總RNA，核酸測定儀測定濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性；-80℃保存。

1.3 研究方法

1.3.1 全血RNA提取 加入1 mL Trizol，充分裂解細胞，加入 200 μL 氯仿，劇烈振蕩 15 s，室溫放置 3 min，12 000 r/min，4℃，離心15 min。吸取上層水相，至另一離心管中。加入1.5倍體積異丙醇充分混勻，室溫放置10 min。12 000 r/min，4℃，離心10 min，RNA沉淀于管底，傾倒上清，沉淀物用75%乙醇洗滌2次，室溫晾干10 min，加入適量無RNase水充分溶解，調(diào)整RNA濃度。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR檢測 miRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為 20 μL，0.5 g/L 總 RNA 1 μL，2×反轉(zhuǎn)錄緩沖混合物 10 μL，RNase Free 水 5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶 2 μL，0.1%BSA 2 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為 37℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。熒光定量 PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，cDNA 模板 2 μL， 水 8.5 μL，SYBR Green 12.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃10 s；變性和延伸95℃5 s；60℃ 20 s，共40個循環(huán)。引物采用在線設(shè)計軟件：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/；管家基因U6為內(nèi)參照，測得的數(shù)據(jù)用平均相對含量表示。引物由invitrogen合成，引物序列見表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR引物序列（5'-3'）

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，比較兩組間差異采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血miR-29a-3p在活動性肺結(jié)核和結(jié)核潛伏感染者中的表達

對活動性肺結(jié)核患者和LTBI外周血miR-29a-3p數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表明，外周血miR-29a-3p表達在LTBI（1.16±0.65）中明顯高于活動性肺結(jié)核患者組（0.71±0.32）（P＜0.05）。見圖1。

2.2 外周血miR-365a-3p在活動性肺結(jié)核和結(jié)核潛伏感染者中的表達

對活動性肺結(jié)核患者和LTBI外周血miR-365a-3p數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表明，活動性肺結(jié)核組外周血miR-365a-3p 表達（0.32±0.71）與 LTBI（0.43±0.51）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 結(jié)核潛伏感染者外周血miR-29a-3p表達與結(jié)核菌特異性酶聯(lián)免疫斑點數(shù)相關(guān)性分析

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，LTBI外周血miR-29a-3p表達與結(jié)核菌特異性酶聯(lián)免疫斑點數(shù)呈負相關(guān) （r=-0.42，P=0.02）。見圖3。

3 討論

miRNA在細胞生長發(fā)育、分化、增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生等發(fā)生發(fā)展中均起到重要作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs表達失調(diào)與多種疾病發(fā)生（如病毒感染、心血管疾病、肺部疾病、纖維化、腫瘤等）密切相關(guān)。近年來研究也發(fā)現(xiàn)miRNA可以參與調(diào)節(jié)免疫細胞的成熟、增殖、分化和活化，miRNA通過選擇性表達，干擾、降解或抑制靶基因的mRNA，從而調(diào)控免疫反應(yīng)，其在固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均起到重要作用，如通過下調(diào)信號通路TCR中多種蛋白磷酸激酶活性，調(diào)節(jié)TCR信號通路強度[4]；通過下調(diào)促凋亡蛋白和腫瘤抑制因子，促進T細胞、B細胞增殖；通過下調(diào)SOCS1信號通路調(diào)節(jié)Treg細胞發(fā)育[5]、通過下調(diào)AID調(diào)節(jié)B細胞抗體類別轉(zhuǎn)換[6-7]，以及通過下調(diào)多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)髓樣細胞的增殖和分化等多種形式。

microRNA-29a（miR-29a）是新近發(fā)現(xiàn)的一個與多種疾病發(fā)生緊密相關(guān)的小分子RNA家族，除3'端非編碼區(qū)堿基區(qū)域（3'untranslated region，3'UTR）外，miR-29 也可與非3'UTR區(qū)內(nèi)的miRNA調(diào)節(jié)元件（miRNA regulator elments，MRE）結(jié)合發(fā)揮作用。彈性蛋白3'UTR和編碼區(qū)共有14個miR-29的結(jié)合位點，熒光素酶報告基因分析方法證實：miR-29可通過同時與編碼區(qū)內(nèi)和3'UTR的MRE結(jié)合來抑制彈性蛋白表達，編碼區(qū)內(nèi)的MRE在miR-29抑制彈性蛋白的表達中起到了協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-29靶基因主要的是細胞外基質(zhì)及遷移蛋白[8-9]，miR-29可直接抑制多種膠原蛋白表達。而膠原蛋白異常聚集可導(dǎo)致纖維化，因此miR-29在抗纖維化中起到重要作用。目前研究也發(fā)現(xiàn)miR-29a在機體免疫反應(yīng)中也起到重要作用，miR-29a靶基因相關(guān)蛋白參與多個信號通路。miR-29a可通過抑制這些信號蛋白表達參與多條信號通路的調(diào)控。其中miR-29a是經(jīng)典Wnt通路中信號分子——T細胞因子（T-cellfactor，TCF）或淋巴樣增強因子（lymphoi denhancer factor，LEF）的負調(diào)控分子，miR-29a可通過靶向降解IFN-γ降低機體對胞內(nèi)病原體的免疫應(yīng)答[10-11]。本研究也發(fā)現(xiàn)LTBI外周血miR-29a-3p表達明顯高于活動性肺結(jié)核患者組，LTBI外周血miR-29a-3p表達與結(jié)核菌特異性酶聯(lián)免疫斑點數(shù)呈負相關(guān)，miR-29a-3p表達高的，結(jié)核菌特異性酶聯(lián)免疫斑點數(shù)卻較少，而結(jié)核菌特異性酶聯(lián)免疫斑點數(shù)反應(yīng)了T細胞分泌IFN-γ的能力，因此miR-29a-3p在肺結(jié)核感染、發(fā)病過程中可能起到重要作用。

IL-6是介導(dǎo)組織炎癥的重要細胞因子，趨化、活化中性粒細胞和單核細胞，促進炎癥遞質(zhì)釋放，增強局部炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)miR-365a可負性調(diào)節(jié)IL-6表達，抑制IL-6蛋白生成，miR-365通過與IL-6基因的3'UTR的MRE結(jié)合，直接抑制IL-6 mRNA表達，除此之外，miR-365也可能通過非直接途徑抑制IL-6表達，體外實驗發(fā)現(xiàn)miR-365調(diào)節(jié)IL-6的能力超過let-7a[12]，因此miR-365a在炎性反應(yīng)中也起到重要作用，但本研究中并未發(fā)現(xiàn)結(jié)核潛伏感染者和活動性肺結(jié)核之間差異，miR-365a-3p在肺結(jié)核發(fā)病中的作用還需進一步研究。

綜上所述，miRNA-29a表達在肺結(jié)核感染、發(fā)病過程中可能起到重要作用。隨著研究的不斷深入，miRNA-29a將在肺結(jié)核診斷及致病機制中作用更加清楚、明確，且有可能成為區(qū)別結(jié)核潛伏感染者的一個重要標志分子。

[1]Calin GA，F(xiàn)erracin M，Cimmino A，et al.A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia[J].N Engl J Med，2005，353（17）：1793-1801.

[2]Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers[J].Nature，2005，435（7043）：834-838.

[3]Chen X，Yang Q，Zhang M，et al.Diagnosis of active tuberculosis in China using an in-house gamma interferon enzyme-linked immunospot assay[J].Clin Vaccine Immunol，2009，16（6）：879-884.

[4]Li QJ，Chau J，Ebert PJ，et al.miR-181a is an intrinsic modulat or of T cell sensitivity and selection[J].Cell，2007，129：147-161.

[5]Lu LF，Boldin MP，Chaudry A，et al.Functi on of miR-146a in cont rol ling T regcell mediated regulation of Th1 responses [J].Cell，2010，142：914-929.

[6]Dorsett Y，McBride KM，Jankovic M，et al.MicroRNA-155 suppresses activation-induced cytidine deaminase mediated MycIgh trans location[J].Imunity，2008，28：630-638.

[7]Teng G，Hakimpour P，Landgraf P，et al.MicroRNA-155 is a negative regulator of activation-induced cytidine deaminase [J].Immunity，2008，28：621-629.

[8]Gebeshuber CA，Zatloukal K，Martinez J.miR-29a suppresses tristetraprolin，which is a regulator of epithelial polarity and metastasis[J].EMBO Rep，2009，10（4）：400-405.

[9]Fort A，Borel C，Migliavacca E，et al.Regulation of fibrinogen production by microRNAs[J].Blood，2010，116（14）：2608-2615.

[10]Kapinas K，Kessler C，Ricks T，et al.MiR-29 modulates Wnt signaling in human osteoblasts through a positive feedback loop[J].J Biol Chem，2010，285（33）：25221-25231.

[11]Sharbati J，Lewin A，Kutz-Lohroff B，et al.Integrated microRNA-mRNA-analysis of human monocyte derived macrophages upon mycobacterium avium subsp，homin issuis infection [J].PLoS One.2011，6（5）：20258.

[12]Xu Z，Xiao SB，Xu P，et al.miR-365，a novel negative regulator of interleukin-6 gene expression，is cooperatively regulated by Sp1 and NF-kappa B[J].J Biol Chem，2011，286（24）：21401-21412.