復(fù)方雙參合劑對(duì)小鼠耐缺氧作用的影響

尹東鋒 地里夏提·白克力 趙林雯

1.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院藥劑科，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆尼勒克縣人民醫(yī)院藥劑科，新疆尼勒克 835700

我國(guó)西部的高原地區(qū)環(huán)境較為惡劣，特別是缺氧嚴(yán)重威脅著當(dāng)?shù)剀娒竦纳眢w健康。我國(guó)的中藥及其提取物在機(jī)體耐缺氧方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，特別是復(fù)方中藥功能制劑，作用效果持久穩(wěn)定，毒副作用小[1]。丹參（Salvia miltiorrhiza）和人參（Panax ginseng）是使用悠久的傳統(tǒng)中藥，現(xiàn)代藥理研究證明，丹參具有擴(kuò)張冠脈血管、保護(hù)心肌、抗腦缺血、改善微循環(huán)和抗氧化等藥理作用[2]，筆者前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明丹參水提取物可以明顯延長(zhǎng)小鼠常壓密閉缺氧情況下的存活時(shí)間，并且可以改善小鼠KCN中毒狀況，避免小鼠死亡[3]。人參的主要活性成分是人參皂苷，有較強(qiáng)的清除氧自由基的作用，可明顯延長(zhǎng)低壓和常壓缺氧條件下小白鼠的存活時(shí)間[4]。本實(shí)驗(yàn)將丹參水提取物和人參總皂苷經(jīng)過(guò)組方，考察復(fù)方雙參合劑對(duì)常壓缺氧小鼠的保護(hù)作用，并探討小鼠在急性減壓缺氧條件下，復(fù)方雙參合劑對(duì)小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）以及腦含水量的影響，為丹參和人參的復(fù)方制劑成為重要的抗缺氧藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 昆明種小白鼠100只，全雄，體重18～22 g，由新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SYXK（新）2011-0008。

1.1.2 儀器 超速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TCL-16B）；電子天平（METTLER TOLEDO AE-240）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（上海安泰分析儀器有限公司，型號(hào)：AT-858）；低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙 （貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司，型號(hào)：FLYDWC50-IA）；秒表。

1.1.3 藥品與試劑 丹參提取物 （西安鴻生生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：100817）；人參提取物（含人參皂苷80%，陜西森費(fèi)高科實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：20110312）；紅景天膠囊（四川銀龍藥業(yè)，批號(hào)：110601）；鈉石灰（威海海格瑞醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：101206）；SOD ELISA 試劑盒、MDA ELISA 試劑盒、LDH ELISA試劑盒（進(jìn)口分裝，北京雅安達(dá)生物科技有限公司，批號(hào)：201201）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn) 將50只小鼠按體重隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為空白組、丹參組、人參組、復(fù)方雙參組、紅景天組，連續(xù)灌胃給藥20 d，于末次給藥1 h后，將各組動(dòng)物分別放入盛有5 g鈉石灰的250 mL磨口廣口瓶?jī)?nèi)（每瓶1只小鼠），用凡士林封瓶口，蓋嚴(yán)，使之不漏氣，立即計(jì)時(shí)，以呼吸停止為指標(biāo)，記錄小鼠存活的時(shí)間。

1.2.2 小鼠減壓缺氧實(shí)驗(yàn) 將50只小鼠按體重隨機(jī)分成5組，每組10只，實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式和劑量同“1.2.1”項(xiàng)下內(nèi)容。于末次灌胃后1 h，將所有小鼠置于低壓艙內(nèi)，調(diào)整壓力漸減，以3 m/s將裝置內(nèi)壓力勻速降低，減至相當(dāng)于海拔7000 m時(shí)停止，在此壓力下維持7 h，造成小鼠急性低氧狀態(tài)，完成預(yù)定缺氧時(shí)間后將裝置內(nèi)壓力升至正常大氣壓，取出小鼠迅速摘眼球取血，分離血清，之后斷頭處死取腦和心臟。其中左半腦用于腦含水量的測(cè)定，右半腦及心臟稱重后按 1∶7（M/V）加入 0～4℃的生理鹽水制成組織勻漿，離心，取上清液，和血清進(jìn)行相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) 用干濕質(zhì)量法測(cè)定腦含水量，各組取右半腦稱重，置50℃烘箱烘干至恒重，計(jì)算腦含水量[腦含水量（%）=（濕重量-干重量）/濕重量×100%]。ELISA 法測(cè)定血清，腦勻漿上清液，心臟勻漿上清液中的SOD、MDA及LDH。SOD、MDA和LDH的測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)

與空白組相比，丹參組、人參組、復(fù)方雙參組及紅景天組均可顯著延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間，其中復(fù)方雙參組常壓密閉缺氧時(shí)間比空白組提高了45.95%（P＜0.01），與陽(yáng)性對(duì)照紅景天組、丹參組和人參組相比，小鼠常壓密閉缺氧時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方雙參合劑對(duì)常壓密閉缺氧小鼠存活時(shí)間的影響

2.2 對(duì)減壓缺氧小鼠腦含水量的影響

與空白組相比，除丹參組外，其余給藥組與空白組相比，可以顯著降低小鼠腦含水量（P＜0.01），人參組、復(fù)方雙參組和紅景天組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方雙參合劑對(duì)減壓缺氧小鼠腦含水量的影響（%，±s）

表2 復(fù)方雙參合劑對(duì)減壓缺氧小鼠腦含水量的影響（%，±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與紅景天組比較，△△P＜0.01；“-”代表無(wú)數(shù)據(jù)

空白組（陰性對(duì)照）丹參組人參組復(fù)方雙參組紅景天組（陽(yáng)性對(duì)照）10 10 10 10 10-0.2 g/kg 0.1 g/kg 0.1 g∶0.2 g/kg 0.6 g/kg 75.63±0.95 76.07±1.08△△74.03±1.08**73.33±0.49**73.68±0.67**組別 動(dòng)物數(shù)（只） 劑量 腦含水量

2.3 對(duì)減壓缺氧小鼠腦中生化指標(biāo)的影響

與空白組相比，給藥組小鼠腦中的SOD含量均有所增加，但是各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥組小鼠腦中MDA含量均有所下降，與空白組相比，其中人參組、復(fù)方雙參組和紅景天組小鼠腦中MDA含量有顯著降低（P＜0.01），并且復(fù)方雙參組與其余各組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與空白組相比，給藥各組小鼠腦中的LDH含量均有所下降，除人參組外，其余各給藥組小鼠腦中的LDH含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），并且復(fù)方雙參組與其余各給藥組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表3。

2.4 對(duì)減壓缺氧小鼠心臟中生化指標(biāo)的影響

與空白組相比，丹參組小鼠心臟中的SOD含量有所減少，而MDA含量有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。人參組中，小鼠心臟中的SOD含量與空白組相比顯著增加（P＜0.05），與復(fù)方雙參組和紅景天組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MDA含量與與空白組相比顯著增加（P＜0.01），但顯著低于復(fù)方雙參組（P＜0.01）?？张c空白組相比，復(fù)方雙參組和紅景天組小鼠心臟中的SOD含量顯著增加（P＜0.01），并且MDA含量顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），而復(fù)方雙參組小鼠心臟中的MDA含量顯著低于紅景天組（P＜0.01）。結(jié)果見表4。

表3 復(fù)方雙參合劑對(duì)減壓缺氧小鼠腦中生化指標(biāo)的影響（±s）

表3 復(fù)方雙參合劑對(duì)減壓缺氧小鼠腦中生化指標(biāo)的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與紅景天組比較，△△P＜0.01；“-”代表無(wú)數(shù)據(jù)；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；LDH：乳酸脫氫酶

空白組（陰性對(duì)照）丹參組人參組復(fù)方雙參組紅景天組（陽(yáng)性對(duì)照）10 10 10 10 10-0.2 g/kg 0.1 g/kg 0.1 g∶0.2 g/kg 0.6 g/kg組別 動(dòng)物數(shù)（只） 劑量183.84±17.92 195.10±35.20 197.56±24.96 199.53±38.58 194.21±21.43 SOD（U/mL）6.13±0.36 5.94±0.51△△4.92±0.52**3.76±0.62**△△4.87±0.66**9.00±0.67 8.03±0.76*△△8.22±1.55△△3.44±1.12**△△4.78±1.13**△△MDA（nmol/mL） LDH（IU/L）

2.5 對(duì)減壓缺氧小鼠血清中生化指標(biāo)的影響

與空白組相比，給藥各組小鼠血清中的SOD含量均有所增加，除丹參組外，其余給藥組與空白組相比較，小鼠血清中的SOD含量有顯著性的增加（P＜0.01），復(fù)方雙參組與其它給藥組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。除人參組外，給藥各組小鼠血清中的MDA含量都有所下降，其中復(fù)方雙參組和紅景天組與空白組相比動(dòng)物數(shù)（只）（P＜0.01），而復(fù)方雙參組和紅景天組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白組相比，給藥各組中小鼠血清的LDH含量均有所增加，其中復(fù)方雙參組和紅景天組與空白組相比小鼠血清的LDH含量有顯著提高（P＜0.01），而復(fù)方雙參組和紅景天組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表5。

表4 復(fù)方雙參合劑對(duì)減壓缺氧小鼠心臟中生化指標(biāo)的影響（±s）

表4 復(fù)方雙參合劑對(duì)減壓缺氧小鼠心臟中生化指標(biāo)的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與紅景天組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；“-”代表無(wú)數(shù)據(jù)；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

空白組（陰性對(duì)照）丹參組人參組復(fù)方雙參組紅景天組（陽(yáng)性對(duì)照）10 10 10 10 10-0.2 g/kg 0.1 g/kg 0.1 g∶0.2 g/kg 0.6 g/kg組別 動(dòng)物數(shù)（只） 劑量138.55±8.22 120.83±9.50△△174.55±24.35*205.46±21.99**198.87±28.87**4.18±0.67 4.36±0.52△3.16±0.47**1.31±0.84**△△3.55±0.64*SOD（U/mL） MDA（nmol/mL）

3 討論

丹參和人參在我國(guó)已有上千年的藥用歷史，人參具有“大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津安神”之功能。有報(bào)道，人參的活性成分人參皂苷對(duì)心肌及腦缺血再灌注損傷有很好的保護(hù)作用[5]。丹參水提取物中的丹酚酸類成分具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化引起的細(xì)胞膜損傷有明顯的保護(hù)作用，可以減少自由基對(duì)心肌組織和腦組織造成的損傷[6]。本實(shí)驗(yàn)將丹參水提取物和人參總皂苷經(jīng)過(guò)組方制備成復(fù)方雙參合劑，考察其在常壓密閉缺氧及減壓缺氧條件下對(duì)小鼠的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方雙參合劑可以顯著延長(zhǎng)常壓密閉缺氧環(huán)境下小鼠的存活時(shí)間（P＜0.01），比空白組延長(zhǎng)了45.95%，但與單方和紅景天相比無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)。干濕質(zhì)量法測(cè)定腦組織含水量是評(píng)價(jià)腦損傷的一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、行之有效的方法[7]，本實(shí)驗(yàn)將各組小鼠暴露在相當(dāng)于海拔7000 m高度的低壓艙中7 h，結(jié)果表明復(fù)方雙參合劑可以顯著降低小鼠減壓缺氧環(huán)境下腦含水量，說(shuō)明其可以緩解小鼠急性缺氧引成的腦水腫，對(duì)急性缺氧引成的腦損傷有一定的保護(hù)作用。為了進(jìn)一步了解復(fù)方雙參合劑對(duì)小鼠抗缺氧能力的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)測(cè)定了在急性減壓缺氧狀態(tài)下小鼠腦、心臟和血液中SOD、MDA以及LDH的水平，這些生化指標(biāo)可以反映機(jī)體抗急性缺氧能力。SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶，可有效清除OH、O2-、H2O2等多種自由基，減輕缺血、缺氧時(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化的損傷。膜脂質(zhì)過(guò)氧化是細(xì)胞功能障礙和死亡的原因之一，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量增高，表示更多的細(xì)胞功能遭到破壞。當(dāng)人體由低海拔進(jìn)入高海拔（3000 m以上）時(shí)，機(jī)體發(fā)生一系列氧自由基代謝改變，主要包括SOD降低與MDA升高，這種由低氧環(huán)境引起的抗氧化能力降低及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)即為氧化脅迫，這可能與許多高原疾病的發(fā)生有關(guān)[8]。機(jī)體進(jìn)入氧化脅迫狀態(tài)，腦部和心臟由于代謝紊亂，造成功能障礙，產(chǎn)生損傷。復(fù)方雙參合劑可以顯著提高急性減壓缺氧小鼠心臟和血清中SOD水平，并顯著降低MDA水平；復(fù)方雙參合劑對(duì)急性減壓缺氧小鼠腦部SOD水平無(wú)顯著影響，但可以顯著降低腦部MDA水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠經(jīng)低氧暴露后腦內(nèi)和心臟內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化物含量明顯增加，復(fù)方雙參合劑可以顯著降低細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度，說(shuō)明復(fù)方雙參合劑通過(guò)抵抗氧自由基與脂質(zhì)過(guò)氧化作用來(lái)保護(hù)急性減壓缺氧對(duì)腦細(xì)胞和心臟細(xì)胞的損傷。各給藥組沒(méi)有提高小鼠腦部LDH水平，并且復(fù)方雙參組和紅景天組還顯著低于空白組。近年來(lái)研究者們開始認(rèn)識(shí)到成年動(dòng)物腦可以利用乳酸作為能量底物，成年動(dòng)物腦不僅可氧化利用血源性乳酸，并且星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠?qū)难褐袛z取的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗崽峁┙o神經(jīng)元作為能源物質(zhì)，乳酸在腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的能量信息交流以及腦功能活動(dòng)和能量代謝的偶聯(lián)中發(fā)揮著重要作用[9]，可能在急性缺氧的條件下，由于能量代謝障礙，腦部為了獲得足夠的能量，需要一定量的乳酸作為能量底物，造成此時(shí)LDH水平較低。復(fù)方雙參合劑可以顯著提高急性減壓缺氧小鼠血清中的LDH水平，表明復(fù)方雙參合劑可以減少血中乳酸的堆積，可能有利于機(jī)體減輕運(yùn)動(dòng)疲勞，有助于提高機(jī)體在低氧環(huán)境下的活動(dòng)能力。本實(shí)驗(yàn)采用的陽(yáng)性對(duì)照紅景天膠囊，是由西藏大花紅景天精致而成，是療效確切的抗缺氧藥物[10]。但是西藏大花紅景天是一種珍貴、稀有的藥用植物，價(jià)格昂貴，而丹參和人參資源豐富，價(jià)格低廉，在本實(shí)驗(yàn)中復(fù)方雙參合劑顯示出了良好的抗缺氧作用，可以通過(guò)進(jìn)一步研究，開發(fā)出適合高原缺氧的有效藥物制劑。

表5 復(fù)方雙參合劑對(duì)減壓缺氧小鼠血清中生化指標(biāo)的影響（±s）

表5 復(fù)方雙參合劑對(duì)減壓缺氧小鼠血清中生化指標(biāo)的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與紅景天組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；“-”代表無(wú)數(shù)據(jù)；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；LDH：乳酸脫氫酶

空白組（陰性對(duì)照）丹參組人參組復(fù)方雙參組紅景天組（陽(yáng)性對(duì)照）10 10 10 10 10 25 mL/kg 0.2 g/kg 0.1 g/kg 0.1 g∶0.2 g/kg 0.6 g/kg組別 動(dòng)物數(shù)（只） 劑量18.68±10.63 21.01±8.03△△40.97±8.77**△98.33±20.18**△△54.13±13.47**SOD（U/mL）1.00±0.19 0.94±0.24△△1.13±0.27△△0.23±0.10**0.15±0.06**1.98±0.56 2.16±0.58△△2.24±0.41△△5.27±0.91**4.80±0.96**MDA（nmol/mL） LDH（IU/L）

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