高效液相色譜法測定不同廠家銀翹解毒片中連翹酯苷A的含量

張宏偉 龔 韜 嚴文利 李 靜

1.北京積水潭醫(yī)院，北京 100035；2.北京市衛(wèi)生局臨床藥學研究所，北京 100035

銀翹解毒片收載于《中國藥典》2010年版，為臨床常用中成藥，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹葉、甘草9 味藥組成，具有疏風解表，清熱解毒功效。用于風熱感冒，癥見發(fā)熱頭痛、咳嗽口干、咽喉疼痛[1]。連翹為銀翹解毒片的主要藥味，實驗證明，連翹酯苷是連翹的主要成分之一，具有一定的活性，對革蘭解毒片的主要藥味。實驗證明，連翹酯苷是連翹的主要成分之一，具有一定的活性，對革蘭氏陰性菌所致的感染有很好的對抗作用[2]，對呼吸道常見病毒有一定的抑制作用[3]。隨著近年來對連翹有效成分的深入研究，發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮抗菌作用的主要成分連翹酯苷，包括連翹酯苷A、B、C、D、E等，尤以連翹酯苷A 含量最高[4]?，F(xiàn)代研究表明，連翹酯苷A 具有極強的抗菌及抗病毒活性，為連翹主要有效成分之一[5]。因此對連翹及含有連翹的制劑進行質(zhì)量評價時，以連翹酯苷A 作為評價指標更客觀、合適[6]?！吨袊幍洹?010年版連翹中增加了連翹酯苷A 含量測定的方法[7]，而銀翹解毒片項下并無連翹酯苷A的含量測定方法及其含量標準。本實驗采用高效液相色譜法對銀翹解毒片中連翹酯苷A 進行了含量測定，方法簡單，易于操作，并且準確度、精密度、靈敏度、穩(wěn)定性等指標均符合要求，因此可作為檢測和控制該制劑質(zhì)量的含量指標。同時又對來自全國不同廠家的銀翹解毒片中連翹酯苷A的含量進行測定，結(jié)果顯示在0.038%～0.286%之間，差距很大。因此應(yīng)當完善銀翹解毒片的質(zhì)量控制標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津2010 高效液相色譜儀；Kromasil100AC18（5μm，150 mm ×4.6 mm） 色譜柱；METTLER TOLEDO XP105型分析天平；KQ-500DB型超聲波清洗儀；

1.2 試藥

連翹酯苷A對照品（天津馬克生物技術(shù)有限公司，純度>98%）；銀翹解毒片（A 廠家：北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號：1121179；B 廠家：陜西利君現(xiàn)代中藥有限公司，批號：100706；C 廠家：廣西禪方藥業(yè)有限公司，批號：110401；D 廠家：佛山德眾藥業(yè)有限公司，批號：11006；E 廠家：貴州百花醫(yī)藥股份有限公司，批號：110801；F 廠家：新疆庫爾勒龍之源藥業(yè)有限公司，批號：20100803；G 廠家：江西心誠藥業(yè)有限公司，批號：20110501；H 廠家：云南省騰沖制藥廠，批號：110613；I 廠家：桂林中族中藥股份有限公司，批號：110801）乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

色譜柱：Kromasil 100A C18（5 μm，150 mm×4.6 mm）；流動相：乙腈-0.4%冰醋酸（13∶87）；流速 1.0 mL/min；檢測波長330 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL；理論塔板數(shù)按連翹酯苷A 計算應(yīng)不低于5 000。依上述色譜條件，精密吸取連翹酯苷A對照品溶液及供試品溶液各10 μL，分別進樣，記錄色譜圖，見圖1、2。本實驗條件下，連翹酯苷A 與其他化學成分能達到基線分離。

圖2 銀翹解毒片樣品高效液相色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取連翹酯苷A對照品適量，加甲醇制成每1 毫升含68.4 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品10 片，研細，混勻，取1 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理（功率 500 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取濃度為0.228 mg/mL的連翹酯苷A對照品溶液 1、2、3、4、5、6、7、8 μL 注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標進行線性回歸，計算回歸方程為：Y=9281.393+1 434 119.256X，r=0.999 99，結(jié)果表明連翹酯苷A 進樣量在0.228～1.824 μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.4 空白考察

按處方工藝制備不含連翹的樣品，按供試品溶液的制備方法制備成空白溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，得空白圖譜，見圖3。結(jié)果表明空白無干擾。

2.5 中間精密度試驗

分別用不同的儀器（島津LC-2010 高效液相色譜儀、島津LC-10A 高效液相色譜儀）及不同的色譜柱（Kromasil 100A C18，5 μm，150 mm×4.6 mm，Agilent ZORBAX C18，5 μm，250 mm ×4.6 mm）對同一批樣品（A 廠家，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠：批號1121179）進行測定，計算，連翹酯苷A 含量的RSD 為0.84%。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（A 廠家，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠：批號1121179）的銀翹解毒片粉末6份，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，進樣分析，結(jié)果制劑中連翹酯苷A的平均含量為0.151%，RSD 為0.62%，表明該法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10 h 進行測定，根據(jù)測定的連翹酯苷A 峰面積的結(jié)果計算RSD 為0.44%，表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 準確度（回收率）試驗

取同一批樣品（A 廠家，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠：1121179）的銀翹解毒片粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，各精密加入濃度為0.037 2 mg/mL的連翹酯苷A對照品溶液20 mL，按供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項下的色譜條件進樣10 μL 測定，計算回收率。結(jié)果測得回收率在98.18%～100.22%之間，平均回收率為99.16%，RSD 為0.76%。見表1。

圖1 連翹酯苷A對照品高效液相色譜圖

表1 連翹酯苷A準確度（回收率）試驗結(jié)果

2.9 樣品測定

取9 批不同廠家的銀翹解毒片，按供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項下的色譜條件進樣10 μL 測定，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 不同廠家銀翹解毒片中連翹酯苷A的含量（n=2）

3 討論

3.1 提取溶媒及溶劑量的選擇

本實驗分別考察了用甲醇及70%甲醇溶液作為提取溶媒，對樣品中連翹酯苷A 提出率的影響。結(jié)果表明，兩種溶媒無明顯差異，故選擇甲醇作為提取溶媒。同時又對提取溶劑量進行了考察，分別用甲醇15、20、25 mL 提取，考察對樣品中連翹酯苷A 提出率的影響。結(jié)果表明提取溶劑量對樣品提取無顯著影響，在保證樣品提取完全的基礎(chǔ)上，同時減少溶劑的使用，故采用20 mL 甲醇提取。

3.2 提取時間的選擇

分別對樣品超聲處理20、30、40 min，樣品中連翹酯苷A的含量基本一致，故選擇超聲處理30 min。

3.3 含量測定

連翹是銀翹解毒片的主要成分，其有效成分的含量直接影響著藥品的質(zhì)量，臨床用藥的療效，夏伯侯等[8]為《中國藥典》2010年版建立了連翹藥材中連翹酯苷A的含量測定方法，也充分證明了連翹酯苷A 作為連翹的有效成分之一，其含量標準測定的意義。因此此項研究參考《中國藥典》2010年版對連翹酯苷A 含量測定的方法，對銀翹解毒片中連翹酯苷A的含量進行了測定，操作方法簡便，靈敏，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，所以可用于銀翹解毒片中連翹酯苷A的質(zhì)量控制。同時運用HPLC 法測定不同廠家銀翹解毒片中連翹酯苷A的含量，測定結(jié)果顯示九個不同廠家的數(shù)值均不相同，其含量在0.038%～0.286%，相差甚遠，這勢必會對臨床療效產(chǎn)生一定的影響。由此可見雖然《中國藥典》2010年版比起以往版本已經(jīng)提高了質(zhì)量控制標準，但是因為只對此制劑中極少的藥效成分規(guī)定了含量標準，作為有效成分之一的連翹脂苷A 沒有含量標準，所以無法更全面地控制市場流通渠道中銀翹解毒片的質(zhì)量。因此呼吁相關(guān)部門完善銀翹解毒片的質(zhì)量控制標準，更好地保證藥品的質(zhì)量及其臨床的療效。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1088-1089.

[2]馮淑怡，李先榮，孫建寧.連翹酯苷抗感染、解熱作用研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2006，6（10）：73-75.

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[5]靖會，李教社，楊銀京.不同部位、不同產(chǎn)地及不同采集時間連翹中連翹酯苷 A 的含量測定[J].陜西中醫(yī)，2010，31（10）：1406-1407.

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