經(jīng)空腸注入大承氣湯對急性胰腺炎大鼠細胞因子和胰腺細胞凋亡的影響

田 明 丁治國 陳振宙 魯香鳳 王 廣

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院普外科，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院病理科，北京 100700

大承氣湯治療急性胰腺炎的療效已得到廣大臨床工作者的認同。研究證明大承氣湯有促進腸蠕動、防止腸道細菌及毒素移位、控制全身炎癥反應(yīng)綜合征、抑制促炎因子等作用[1]。細胞凋亡或者壞死是胰腺自身消化、微循環(huán)障礙、炎性介質(zhì)等多個因素作用于胰腺細胞后產(chǎn)生的最終影響，被認為是急性胰腺炎發(fā)病機制的終末效應(yīng)階段[2]。如細胞以凋亡方式死亡，則不引起炎癥反應(yīng)及胰外臟器功能損害，而只出現(xiàn)輕型胰腺炎。目前，大承氣湯對急性胰腺炎胰腺腺泡細胞凋亡的影響仍為空白。因急性胰腺炎可延緩胃排空，造成惡心、嘔吐，經(jīng)空腸給藥可有效避免嘔吐導(dǎo)致給藥失敗。本實驗建立急性重癥胰腺炎大鼠模型，觀察空腸內(nèi)注入大承氣湯對急性胰腺炎大鼠細胞因子的影響和胰腺腺泡細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物雄性SD大鼠，數(shù)目90只，體重250～280 g。大承氣湯（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房提供），配方為大黃 12 g、枳實 12 g、厚樸 15 g、芒硝 9 g，煎為 200 mL。

1.2 實驗分組

大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組各30例。假手術(shù)組僅行開腹、經(jīng)胃造口置空腸管術(shù)。模型組采用3.5%?；悄懰徕c胰周注射法制造大鼠急性胰腺炎模型，假手術(shù)組和模型組術(shù)后2 h 一次性空腸內(nèi)注入10 mL 生理鹽水。治療組在模型組基礎(chǔ)上術(shù)后2 h 按10 mL/kg的劑量一次性空腸內(nèi)注入大承氣湯。

1.3 實驗方法

大鼠術(shù)前空腹12 h，按分組標記后，稱重。用10%水合氯醛（400 mg/kg 體重）腹腔注射麻醉，開腹。假手術(shù)組大鼠：開腹后，行胃造瘺術(shù)，然后經(jīng)胃造口置入內(nèi)徑1.0 mm硅膠管于空腸上段2.0cm處，關(guān)腹。模型組及治療組大鼠：開腹后，用1 mL 注射器向胰周被膜內(nèi)勻速注射3.5%?；悄懰徕c約1 mL，使整個胰腺均勻隆起。然后經(jīng)胃造口置入內(nèi)徑1.0 mm 硅膠管于空腸上段2.0cm處。檢查無消化道漏，關(guān)腹。各組大鼠術(shù)后10～15 min 清醒后限制飲水，籠中自由活動。術(shù)后2 h，治療組按10 mL/kg的劑量經(jīng)造瘺硅膠管一次性空腸內(nèi)注入大承氣湯，假手術(shù)組和模型組經(jīng)造瘺硅膠管一次性空腸內(nèi)注入相應(yīng)體積的生理鹽水。給藥24 h后開腹，腹主動脈取血1 mL，于4℃下離心10 min，轉(zhuǎn)速1 500 r/min。取上清，分裝凍存于-80℃冰箱。切取胰腺標本，置20%中性磷酸鹽緩沖液-甲醛中固定，送組織病理檢查。

1.4 檢測方法

1.4.1 檢測項目及方法 大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素 1β（IL-1β）、白介素 18（IL-18）集中采用 ELISA 法檢測 TNF-α、IL-1β、IL-18 濃度變化。

1.4.2 胰腺炎組織損傷病理評分標準 胰腺組織病理學(xué)積分采用改良Grewal 法[3]對胰腺炎組織損傷進行定量評估，病理評分標準如下。①水腫：0分，無水腫；1分，胰腺小葉間隙增寬；2分，重度葉間隙增寬；3分，腺泡間隙增寬；4分，細胞間隙增寬。②炎癥：以每個高倍視野（HPF）中的炎性細胞數(shù)計算，每5個炎細胞計0.5分，超過30個計4分。③出血：以每個 HPF 計算，0分，無出血；1分，1～2個出血點；2分，3～4 個出血點；3 分，5～6 個出血點；4 分，7～8個或更多出血點。④壞死程度：以每個HPF 計壞死細胞數(shù)，0分，1～4個/HPF；1 分，5～8 個/HPF；2 分，9～12 個/HPF；3 分，13～16 個/HPF；4分，17個以上或廣泛融合的壞死。連續(xù)觀察8～10個視野，根據(jù)各個視野的水腫、炎癥、出血和壞死各類積分分別計算均數(shù)；各均數(shù)相加得每只大鼠的病理積分總分。

1.4.3 計算胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù) 每個大鼠的胰腺石蠟標本塊取8個切片，每張切片選取8個陽性細胞數(shù)最多的高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞和其中的凋亡細胞，計算800個腺泡細胞中陽性細胞所占的百分比作為每只大鼠胰腺組織的凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/800×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.0版統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 死亡情況

模型組死亡3例，治療組死亡2例，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。假手術(shù)組大鼠無死亡。

2.2 外周血細胞因子、病理學(xué)積分、凋亡指數(shù)的結(jié)果

治療組 IL-1β、IL-18、TNF-α 濃度均低于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組和治療組病理學(xué)積分均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），表明造模成功；治療組病理學(xué)積分低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療組凋亡指數(shù)大于模型組（P＜0.05）。見表1。

3 討論

急性胰腺炎是外科常見急腹癥，屬祖國醫(yī)學(xué)“腹痛”、“膈痛”、“胃脘痛”、“脾心痛”之范疇，以上腹部急性疼痛為主癥。以氣滯血瘀、毒瘀互結(jié)為病理特點[4]。輕型胰腺炎易于治療，預(yù)后好；重癥胰腺炎病情兇險，常伴其他臟器功能損害，預(yù)后差，病死率高。如何在急性胰腺炎早期控制其病情進展，預(yù)防急性胰腺炎向重癥胰腺炎發(fā)展，減輕重癥胰腺炎壞死范圍等是被研究者廣泛關(guān)注的問題。研究者發(fā)現(xiàn)，在急性胰腺炎起病初期，各類損傷因素損傷胰腺腺泡細胞。如胰腺腺泡細胞死亡以壞死方式為主，則引發(fā)炎癥反應(yīng)，繼而觸發(fā)白細胞系統(tǒng)何細胞因子網(wǎng)絡(luò)的級聯(lián)放大反應(yīng)，損傷其他臟器，誘發(fā)多臟器功能衰竭，從而導(dǎo)致重癥胰腺炎的發(fā)生；如胰腺腺泡細胞死亡以凋亡方式為主，則不會引起嚴重的炎癥反應(yīng)和其他臟器損害，表現(xiàn)為輕型胰腺炎[5]。目前，早期應(yīng)用藥物干預(yù)來誘導(dǎo)胰腺腺泡細胞凋亡是治療急性胰腺炎新的研究熱點。

表1 各組細胞因子濃度和病理學(xué)積分、凋亡指數(shù)結(jié)果比較（pg/mL，±s）

表1 各組細胞因子濃度和病理學(xué)積分、凋亡指數(shù)結(jié)果比較（pg/mL，±s）

注：與模型組比較aP＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.01；IL-1β：白介素1β；IL-18：白介素18；TNF-α：腫瘤壞死因子α

組別 例數(shù) IL-1β IL-18 TNF-α 病理學(xué)積分（分）凋亡指數(shù)（%）假手術(shù)組模型組治療組F值P值30 27 28 51.29±10.91 170.45 ±26.74 1，58.61±21.31a 299.01＜0.01 49.06±11.76 230.67 ±89.52 187.78±67.28a 63.82＜0.01 15.10 ±5.35 72.26±16.58 58.32 ±12.17a 175.70＜0.01 0.32±0.10 8.46±2.97b 7.24 ±1.31ab 166.08＜0.01 0.79±0.11 4.10±1.79 7.67 ±3.13c 80.73＜0.01

細胞因子是由體內(nèi)免疫細胞等主動分泌的一組小分子量可溶性蛋白及多肽。細胞因子正常生理狀態(tài)下表達較少。當(dāng)有內(nèi)、外界各種致炎因素刺激時，免疫系統(tǒng)被激活，免疫細胞分泌出大量細胞因子。TNF-α、IL-1β和IL-18是目前研究最充分的致炎因子，在急性胰腺炎早期，即可發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β和IL-18的表達增強，且與急性胰腺炎的嚴重程度呈正相關(guān)，可作為判斷急性胰腺炎預(yù)后的根據(jù)[6]。

其中，血清TNF-α對細胞凋亡調(diào)控表現(xiàn)出雙面性，即低濃度的TNF-α能誘導(dǎo)細胞凋亡，促進炎癥愈合；而高濃度的TNF-α則導(dǎo)致胰腺腺泡細胞壞死。一方面，TNF-α通過與其受體結(jié)合誘導(dǎo)細胞凋亡。另一方面，TNF-α激發(fā)一系列級聯(lián)放大反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放，引起胰腺及胰腺外組織器官損傷甚至壞死。此外，抑制血清IL-1β和IL-18的水平可以促進胰腺腺泡細胞凋亡，減輕胰腺的炎癥反應(yīng)。

大承氣湯由大黃、芒硝、枳實、厚樸組成，具有通里攻下、疏通氣機之功效。方中大黃苦寒瀉熱，祛瘀通便，蕩滌腸胃邪熱積滯，消除致病之因為君藥；然大黃苦寒，長于瀉下攻積，軟堅之力欠佳，燥屎難下，如同無水行舟，輔以芒硝咸寒瀉熱，軟堅潤燥通便為臣藥；兩者相須為用，峻下熱結(jié)之力增強。然積滯內(nèi)阻，致使腑氣不行，佐以厚樸苦溫下氣，除滿下脹，配以枳實苦辛破結(jié)，導(dǎo)滯消痞；兩藥行氣導(dǎo)滯，消痞除滿，助大黃、芒硝推蕩積滯，攻下通便。四藥相合，行氣瀉下并重，六腑通降，氣機暢通。

從現(xiàn)代藥理看，大黃的有效成分是蒽醌類衍生物，可促進大腸蠕動，促進排便[7]。芒硝主要成分為硫酸鈉，其硫酸根離子不易被腸黏膜吸收，從而存留在腸內(nèi)成為高滲性溶液，使腸內(nèi)的水分增加，促進胃腸道蠕動。枳殼能促使胃腸收縮節(jié)律增加，緩解小腸痙攣[8]。厚樸的有效成分是厚樸酚，可緩解小腸平滑肌的痙攣，增強胃腸道蠕動，有利于腸功能的恢復(fù)[9]。

腸道是人體最大的細菌庫[10]。急性胰腺炎時腸功能減退，腸管脹氣，引起腹腔間隙綜合征。腸黏膜屏障破壞[11]。腸道內(nèi)細菌和毒素移位，體內(nèi)免疫細胞分泌大量細胞因子，進而啟動全身炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致胰腺組織壞死和多臟器功能衰竭。而且由于急性胰腺炎多伴惡心、嘔吐，胃內(nèi)給藥無法起到理想效果，所以急性胰腺炎早期的胃腸道用藥途徑應(yīng)為經(jīng)過空腸給藥。

本試驗通過建立急性胰腺炎大鼠模型，觀察空腸內(nèi)注入大承氣湯對大鼠細胞因子、胰腺腺泡細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示對于急性胰腺炎大鼠模型應(yīng)用大承氣湯后，血清IL-1β、IL-18、TNF-α濃度水平均較模型組減低，胰腺組織病理學(xué)積分較模型組明顯減低，胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù)明顯升高。提示大承氣湯具有一定的抑制炎癥反應(yīng)的作用和促進胰腺腺泡細胞凋亡的作用，細胞因子可能是大承氣湯促進胰腺細胞凋亡的中間環(huán)節(jié)。

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