石榴皮提取物體內(nèi)外抗過(guò)敏作用的實(shí)驗(yàn)研究

楊 成， 董 群

(皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教研室，安徽蕪湖241002)

石榴皮Pericarpiu Granati系石榴科 Punica granatum Linn．石榴屬植物石榴的干燥果皮。由于石榴皮中含鞣質(zhì)較多，因而石榴皮常具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗突變、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，但關(guān)于其鞣質(zhì)是否具有抗過(guò)敏活性尚未見(jiàn)報(bào)道［1-3］，其它關(guān)于石榴皮免疫功能的研究報(bào)道也限于免疫調(diào)節(jié)方面［4-6］。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)石榴皮提取物抗過(guò)敏活性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，以便為深入利用石榴皮提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 藥物與試劑 干燥石榴皮、天花粉 (購(gòu)自蕪湖市張恒春大藥房)，息斯敏 (西安楊森制藥有限公司)，透明質(zhì)酸酶 (購(gòu)自Sigma公司)，小鼠組胺ELISA檢測(cè)試劑盒 (購(gòu)自上海研生生化試劑有限公司 )，甲醇，透明質(zhì)酸鉀，硫酸鋁等其它均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明系小鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(蘇)2007—0001］。

2 方法

2.1 石榴皮提取物制備 500 g石榴皮于烘箱烘干，磨碎40目獲得粗粉。以甲醇為提取溶劑，按質(zhì)量與提取劑體積比1∶10(w/v)，4℃提取12 h過(guò)濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃真空濃縮至干作為樣品備用。

2.2 石榴皮體外抗過(guò)敏試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［7］透明質(zhì)酸酶體外抑制實(shí)驗(yàn)，測(cè)定石榴皮提取物對(duì)透明質(zhì)酸的活性的抑制效應(yīng)。向0.5mL酶活力單位為400 u/mL透明質(zhì)酸酶中加入2.5 mmol/L CaCl20.1mL，37℃溫浴20 min，加入生理鹽水溶解的待測(cè)質(zhì)量濃度分別為2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 mg/mL石榴皮提取物0.5 mL、37℃溫浴20 min，加入0.4 mg/mL透明質(zhì)酸鉀0.6mL，37℃溫浴40min，加0.1mol/L NaOH 0.2 mL終止反應(yīng)，冰浴10 min，加1%硼酸0.1 mL，煮沸5 min，冰浴10 min，加2mL P-DAB試劑37℃溫浴20 min，585 nm下測(cè)定OD值。分別將樣品、透明質(zhì)酸酶替換為0.1mol/L pH4醋酸緩沖液設(shè)為對(duì)照和樣品空白對(duì)照，將樣品、透明質(zhì)酸酶替換為醋酸緩沖液作為對(duì)照空白。

抑制率(%)=［(A－B)－(C－D)］/(A－B)×100%

A為對(duì)照管OD585;B為對(duì)照空白管OD585;C為樣品OD585;D為樣品空白對(duì)照管OD585。

2.3 石榴皮體內(nèi)小鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)

2.3.1 致敏及抗血清的制備 健康小鼠6只，體質(zhì)量18～22 g，將3.75 mg天花粉溶于1.5 mL 4%氫氧化鋁凝膠制備懸液腳掌注射，兩只后腳掌各注入0.05 m L，共注射0.1 mL。15 d后，斷頭取血，離心取抗血清備用。

2.3.2 被動(dòng)皮膚過(guò)敏小鼠模型的構(gòu)建 參照文獻(xiàn) ［8］方法，取實(shí)驗(yàn)小鼠30只，隨機(jī)分為正常組，息斯敏 (10 mg/kg)組，提取物高、中、低劑量組 (900 mg/kg，300 mg/kg，100 mg/kg)，每組6只;每天灌胃給藥1次，正常組給等體積蒸餾水，連續(xù)給予7 d。取2.3.1項(xiàng)小鼠混合血清加生理鹽水稀釋成1∶5，每鼠腹壁皮內(nèi)注射兩個(gè)點(diǎn) (相距0.2 cm)，每點(diǎn)0.03 mL。并再連續(xù)給藥2 d，于末次給藥48 h后，每只小鼠進(jìn)行抗原攻擊，尾靜脈注射2.5mg天花粉 (用1%伊文思藍(lán)-生理鹽水配制)0.2 mL，30 min脫臼處死，眼球取血備用，翻轉(zhuǎn)腹部皮膚剪下腹部藍(lán)斑皮膚(0.5 g)，剪碎，浸泡于丙酮生理鹽水溶液 (7∶3)5 mL中48 h，離心取上清液，用分光光度計(jì)610 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸收度，計(jì)算抑制率，評(píng)價(jià)藥物的抗過(guò)敏作用。

抑制率=100%－(用藥組平均光密度/致敏對(duì)照組平均光密度)×100%

2.4 血清中組胺釋放水平的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法試劑盒測(cè)定，嚴(yán)格按說(shuō)明進(jìn)行操作。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (± s)表示，采用F檢驗(yàn)進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn);采用Pearson作相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 石榴皮提取物體外透明質(zhì)酸酶抑制抗過(guò)敏效果 按照2.2項(xiàng)方法測(cè)定不同終質(zhì)量濃度石榴皮提取物對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制效果，結(jié)果由表1可知，當(dāng)終質(zhì)量濃度為2.4 mg/mL時(shí)，對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率為43.2%，且抑制活性與樣品終質(zhì)量濃度呈一定量效關(guān)系，其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為 2.69 mg/mL。

表1 提取物對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制率

3.2 石榴皮提取物體內(nèi)對(duì)小鼠被動(dòng)皮膚抗過(guò)敏效果 由表2結(jié)果表明，以伊文思藍(lán)滲透量為指標(biāo)，經(jīng)F分析，F(xiàn)=3.75，F(xiàn)(4，25)=2.76，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，正常組與息斯敏陽(yáng)性藥物組、高劑量之間存在差異;息斯敏陽(yáng)性藥物組與低劑量組存在差異。說(shuō)明與息斯敏相比，高劑量石榴皮提取物能明顯地降低藍(lán)斑皮膚浸出液光密度值，顯著地抑制小鼠被動(dòng)皮膚通透性，減少伊文思藍(lán)滲透量，具有一定抗過(guò)敏活性。

表2 提取物對(duì)小鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)的影響( ± s，n=6)

表2 提取物對(duì)小鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)的影響( ± s，n=6)

注:與息斯敏組比較，*P＜0.05;與正常組比較，△P＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg－1)吸光值(ODA585nm) 抑制率/%正常組 H2O 0.412±0.012 －息斯敏組 0.01 0.179±0.019△ 56.5石榴皮高劑量組 0.9 0.214±0.018△ 48.1石榴皮中劑量組 0.3 0.285±0.026 30.8石榴皮低劑量組 0.1 0.352±0.031*14.5

3.3 不同給藥組別小鼠血清組胺的水平 由表3結(jié)果，經(jīng)F分析，F(xiàn)=5.69，F(xiàn)(4，25)=2.76，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常組和息斯敏陽(yáng)性藥物組相比，石榴皮提取物中劑量、高劑量能顯著降低實(shí)驗(yàn)小鼠血清中組胺濃度，尤其是高劑量，其效果均好于息斯敏陽(yáng)性藥物組，低劑量效果較差。結(jié)果提示，石榴皮提取物能減少過(guò)敏介質(zhì)組胺的釋放，具有一定的抗過(guò)敏作用。

表3 提取物對(duì)小鼠血清組胺水平的影響 ( ± s，n=6)

表3 提取物對(duì)小鼠血清組胺水平的影響 ( ± s，n=6)

注:與息斯敏組比較，*P＜0.05;與正常組比較，△P＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg－1) 組胺/(μg·L－1)正常組 H2 O 14.3±1.04息斯敏組 0.01 10.4±0.82△石榴皮高劑量組 0.9 8.9±0.75△石榴皮中劑量組 0.3 11.2±1.40△石榴皮低劑量組 0.1 13.9±0.60*

3.4 小鼠血清組胺水平與伊文思藍(lán)滲出量相關(guān)性分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)各組小白鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)的伊文思藍(lán)滲透量光密度與血清組胺含量二者的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果散點(diǎn)圖見(jiàn)圖1，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，伊文思藍(lán)滲透量光密度與血清組胺水平在各實(shí)驗(yàn)組之間存在一定的相關(guān)性，P值為0.007，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.48。

圖1 組胺水平與伊文思藍(lán)吸光值相關(guān)性散點(diǎn)圖

4 討論

現(xiàn)代中藥關(guān)于抗過(guò)敏機(jī)制的研究多集中在過(guò)敏介質(zhì)和Th1/Th2平衡理論［9-10］。而過(guò)敏反應(yīng)是機(jī)體受到某些抗原刺激后出現(xiàn)生理功能紊亂或組織細(xì)胞損傷的異常適應(yīng)性免疫應(yīng)答。中醫(yī)常認(rèn)為對(duì)過(guò)敏癥需從內(nèi)調(diào)整，健脾補(bǔ)腎，調(diào)整機(jī)體免疫系統(tǒng)的紊亂，使機(jī)體整體功能得到恢復(fù)，對(duì)自然環(huán)境由不適應(yīng)變?yōu)檫m應(yīng)，如此方可達(dá)到防治的最終目的。透明質(zhì)酸酶是透明質(zhì)酸的特異性裂解酶，與炎癥、過(guò)敏等病理癥狀存在明顯的相關(guān)性［11］。抑制透明質(zhì)酸酶的活性可使透明質(zhì)酸不被分解，對(duì)維持正常的生理功能，減少過(guò)敏反應(yīng)具有重要意義。而且有研究顯示透明質(zhì)酸酶活性和組胺之間存在明顯的相關(guān)性，透明質(zhì)酸酶活性的抑制實(shí)驗(yàn)已經(jīng)作為篩選抗過(guò)敏藥物的基本方法之一［12-13］。組胺是由機(jī)體肥大細(xì)胞內(nèi)組氨酸脫羧基后產(chǎn)生的一種胺類(lèi)物質(zhì)，介導(dǎo)I型變態(tài)反應(yīng)的重要生物活性介質(zhì)，能引起全身毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增加，平滑肌痙攣。因此，機(jī)體內(nèi)組胺水平的變化可作為過(guò)敏反應(yīng)的檢測(cè)的重要指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)為提高藥物凈度，確保質(zhì)量，利用甲醇為提取劑，經(jīng)低溫、真空濃縮干燥工藝，結(jié)合透明質(zhì)酸酶體外抑制試驗(yàn)和體內(nèi)小鼠皮膚通透性實(shí)驗(yàn)及過(guò)敏介質(zhì)組胺釋放量測(cè)定，分析了石榴皮甲醇提取物的抗過(guò)敏活性，結(jié)果表明石榴皮提取物具有一定的抑制透明質(zhì)酸酶活性，中、高劑量能顯著的阻止過(guò)敏介質(zhì)組胺的釋放量，高劑量是能顯著降低小鼠被動(dòng)皮膚對(duì)伊文思藍(lán)滲透量，顯示出一定的抗過(guò)敏活性，其活性可能與藥物劑量存在一定的量效關(guān)系，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)石榴皮提供參考。但通過(guò)何種方式抑制組胺釋放有待進(jìn)一步了解。通過(guò)二者之間相關(guān)性分析，可以看出，血清中組胺的水平與小鼠皮膚對(duì)伊文思藍(lán)滲透量之間，存在一定的相關(guān)性，但相關(guān)程度不高，相關(guān)系數(shù)僅為0.48，其可能原因，一方面可能是由于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣本過(guò)小;另一方面是機(jī)體能參與過(guò)敏小鼠被對(duì)伊文思藍(lán)滲透的活性介質(zhì)不僅僅只有組胺一種，如血清中如白三烯、前列腺素等多種活性介素也可能參與。

［1］王彩芳，劉延澤．鞣質(zhì)生理活性研究進(jìn)展［J］．國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè)，2001，23(5):278-282．

［2］惠 李，侯天德，葛玉鳳，等．石榴活性成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009(6):24，29．

［3］Negi PS，Jayaprakasha G K，Jena B S．Antioxidant and antimutagenic activities of pomegranate peel extracts［J］．Food Chemistry，2003，80(3):393-397．

［4］呂 琴，劉金寶．石榴皮醇提物對(duì)小鼠體液免疫功能的影響［J］．新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30(5):484-486．

［5］周 萍，欽建偉，杜 偉．石榴皮提取液及其兩種萃取物對(duì)小鼠體液免疫功能的影響［J］．蘇州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，30(6):1201-1203．

［6］吳苗敏，單麗娟．石榴皮水煎液對(duì)脾虛泄瀉模型小鼠免疫功能的影響［J］．新疆中醫(yī)藥，2010，28(2):43-45．

［7］Fujitani N，Sakaki S，Yamaguchi Y，et al．Inhibitory effects ofmicroalgae on the activation of hyaluronidase［J］．J Appl Phycol，2001，13(6):489-492．

［8］李 玲．廣西甜茶抗過(guò)敏成分的提取、純化和結(jié)構(gòu)鑒定［D］．廣西大學(xué)，2009．

［9］華曉東，尹春暉．抗過(guò)敏中藥及其作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］．天津藥學(xué)，2009，21(6):69-72．

［10］Roumier T，Capron M，Dombrowicz D，et al．Pathogen induced regulatory cell populations preventing allergy through the Th1/Th2 paradigm point of view ［J］．Immunol Res，2008，40(1):1-17．

［11］Delaere L，Zeyen T，F(xiàn)oets B，et al．Allergic reaction to hyaluronidase after retrobulbar anaesthesia:a case seriesand review［J］．Int Ophthalmol，2009，29(6):521-528．

［12］魏智蕓，滕建文，黃麗，等．地榆提取物抗氧化與抗過(guò)敏作用研究［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(8):1958-1960．

［13］Sumantran V N，Kulkarni A A，Harsulkar A，etal．Hyaluronidase and collagenase inhibitory activities of the herbal formulation Triphala guggulu［J］．JBiosci，2007，32(4):755-761．