枇杷花醇提物止咳化痰作用實(shí)驗(yàn)研究

陳曉芳， 張 倩， 吳文倩， 劉春宇

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇蘇州215123)

枇杷Eriobotrya japonica(Thunb．)Lindl為薔薇科植物，藥用歷史悠久，具有化痰止咳、和胃降氣之功效，作為傳統(tǒng)中藥，枇杷的研究集中于葉和果實(shí)，對(duì)枇杷花的相關(guān)研究相對(duì)較少，枇杷花氣味香醇獨(dú)特，性溫，可入肺散寒，化痰止咳，潤肺下氣［1-2］。目前，雖有枇杷花止咳方面的藥效研究，但對(duì)其作用機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究未見報(bào)道。另外，枇杷樹在花期進(jìn)行疏花以提高枇杷品質(zhì)，而疏掉的花蕾大多沒有充分利用。為了進(jìn)一步開發(fā)利用枇杷花的資源，課題組對(duì)枇杷花的止咳化痰藥理作用及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，本實(shí)驗(yàn)采用多種動(dòng)物模型觀察了枇杷花醇提物的止咳化痰作用，并初步探討了其作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 電子天平 (EL303梅特勒-托力多儀器);超聲霧化器WH-802型(廣東粵華醫(yī)療器械廠);小鼠/豚鼠玻璃容器(自制);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DZF-6050真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g;豚鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量150～190 g，均由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(蘇)2007—0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK(蘇)2007—0035。

1.3 材料

枇杷花:采于蘇州東山，經(jīng)本院生藥教研室劉春宇教授鑒定為枇杷Eriobotrya japonica(Thunb．)Lindl的花，干燥后備用。

枇杷花醇提物:取枇杷花粉末1000 g，加10倍量95%乙醇，60℃，回流提取2.5 h，過濾，重復(fù)2次，合并濾液，濃縮得浸膏，給藥劑量以相當(dāng)于原藥材質(zhì)量計(jì)算。豚鼠灌胃劑量:枇杷花醇提物高劑量組 (3 g/kg)，枇杷花醇提物中劑量組 (1.5 g/kg)，枇杷花醇提物低劑量組 (0.75 g/kg);小鼠灌胃劑量:枇杷花醇提物高劑量組 (4 g/kg)，枇杷花醇提物中劑量組 (2 g/kg)，枇杷花醇提物低劑量組(1 g/kg)。

念慈庵蜜煉川貝枇杷膏 (香港京都念慈總廠有限公司，批號(hào):Y3808010);P物質(zhì)試劑盒(R＆D分裝);其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 對(duì)氨水引咳小鼠的影響 采用小鼠氨水引咳法［4］，預(yù)實(shí)驗(yàn)用氨水引咳法篩選一批體質(zhì)量18～22 g的昆明小鼠，3 min內(nèi)不發(fā)生咳嗽的小鼠不予選用，待小鼠穩(wěn)定2 d后，取合格小鼠50只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，對(duì)照組 (生理鹽水)、念慈庵蜜煉川貝枇杷膏組 (5.4 g/kg)、枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組，連續(xù)給藥7 d，小鼠每次灌胃0.2 mL/10 g溶液，末次給藥前禁食不禁水12 h，于末次給藥1 h后，將小鼠置于自制密閉玻璃容器中，超聲霧化器噴入氨水20 s后，立即取出小鼠，記錄小鼠咳嗽潛伏時(shí)間和3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

2.2 對(duì)枸櫞酸引咳［3］豚鼠的影響 預(yù)實(shí)驗(yàn)，將豚鼠放入自制密閉玻璃容器內(nèi)，待其在容器內(nèi)穩(wěn)定1 min后，用超聲波霧化吸入器勻速將17.5 g/L的枸櫞酸噴入容器內(nèi)，噴霧時(shí)間為40 s，以豚鼠出現(xiàn)第一聲響亮的咳嗽聲為準(zhǔn)，開始記錄豚鼠咳嗽潛伏期及5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，咳嗽次數(shù)＜10次和＞30次者不予選用。

次日將挑選篩選合格的豚鼠35只隨機(jī)分5組，每組7只，分為枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組，對(duì)照組 (生理鹽水)、念慈庵蜜煉川貝枇杷膏陽性藥物組(10 g/kg)，各組灌胃給藥，對(duì)照組給予生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d，于末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥后1 h按預(yù)實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)引咳實(shí)驗(yàn)，記錄豚鼠咳嗽潛伏期及5 min內(nèi)豚鼠咳嗽次數(shù)。

2.3 對(duì)小鼠酚紅排泌［5］的影響 取昆明種小鼠50只，雌雄各半，分為枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組，對(duì)照組 (生理鹽水)、念慈庵蜜煉川貝枇杷膏組 (5.4 g/kg)，每組10只，各組按上述劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d，模型組則灌胃等體積生理鹽水0.1 mL/10 g，末次給藥前，禁食不禁水12 h，末次給藥30 min后，給小鼠腹腔注射0.5%苯酚紅溶液，劑量為每只0.5 mL，注射1 h后斷頸處死小鼠，沿甲狀軟骨剪下一段氣管，每只小鼠剪下的氣管要求等長，放入離心管中，加入3 mL生理鹽水和1 mol/L的氫氧化鈉溶液0.2 m L，離心 (轉(zhuǎn)速2 000 r/min，時(shí)間5 min)，取上清液，于紫外可見分光光度計(jì)546 nm波長處測量并記錄吸光值。

2.4 對(duì)辣椒素刺激豚鼠C-纖維釋放P物質(zhì)的影響 取35只豚鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組7只。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，模型組按0.4mL/100 g灌胃生理鹽水，灌胃1 h后將豚鼠放入特制的4 000 mL燒杯中，用超聲波霧化器以最大量霧化30μmol/L辣椒素，噴霧2 min，制備辣椒素致豚鼠咳嗽模型，正常組灌胃生理鹽水后不進(jìn)行噴霧。噴霧2 min后，立即取出豚鼠，深度麻醉豚鼠 (水合氯醛，0.1 m L/100 g，腹腔注射)，完整取下氣管心肺組織，用注射器套管注射5 mL冰冷的生理鹽水于氣管，共灌洗3次，收集支氣管肺泡灌洗液 (BALF)，3 500 r/min離心10 min，收集上清液，凍干，用1 mLPBS緩沖液重溶［6］，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定P物質(zhì)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以± s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)氨水引咳小鼠咳嗽的抑制作用 枇杷花醇提物對(duì)氨水引起小鼠咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)的影響，結(jié)果見表1，念慈庵密煉川貝枇杷膏陽性藥物組、枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組均有延長小鼠咳嗽潛伏期和減少小鼠咳嗽次數(shù)的作用，與模型對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，枇杷花醇提物對(duì)氨水引起小鼠咳嗽有良好的抑制作用。

表1 對(duì)小鼠氨水引咳法的咳嗽次數(shù)和咳嗽潛伏期的影響( ± s，n=10)

表1 對(duì)小鼠氨水引咳法的咳嗽次數(shù)和咳嗽潛伏期的影響( ± s，n=10)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1)咳嗽潛伏期/s 3min內(nèi)咳嗽次數(shù)對(duì)照組 － 18.25 ±4．54 27.58 ±6．83念慈庵蜜煉川貝枇杷膏組 5.4 48.42 ±11．77＊＊ 13.00 ±4．13＊＊枇杷花醇提物高劑量組 4 48.17 ±12．22＊＊ 11.25 ±2．60＊＊枇杷花醇提物中劑量組 2 35.50 ±11．15＊＊ 13.75 ±4．83＊＊枇杷花醇提物低劑量組 1 35.17 ±10．14＊＊ 14.00 ±2．63＊＊

3.2 對(duì)枸櫞酸引咳豚鼠咳嗽的抑制作用 如表2所示，與對(duì)照組相比，念慈庵蜜煉川貝枇杷膏陽性藥物組、枇杷花醇提物高劑量組，中劑量組，低劑量組豚鼠咳嗽次數(shù)和咳嗽潛伏期均有顯著差異性 (P＜0.05)，枇杷花醇提物明顯抑制枸櫞酸引起的豚鼠咳嗽，具有顯著的止咳作用。

表2 對(duì)豚鼠枸櫞酸引咳法的咳嗽次數(shù)考察( ± s，n=7)

表2 對(duì)豚鼠枸櫞酸引咳法的咳嗽次數(shù)考察( ± s，n=7)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1)5min內(nèi)咳嗽次數(shù)/次咳嗽潛伏期/s對(duì)照組 － 25.28±6.32 19.57±3.31念慈庵蜜煉川貝枇杷膏組 10 15.43±4.16＊＊ 66.85±8.51＊＊枇杷花醇提物高劑量組 3 13.29±4.46＊＊ 73.00±6.43＊＊枇杷花醇提物中劑量組 1.5 17.71±3.68＊＊ 65.00±9.71＊＊枇杷花醇提物低劑量組 0.75 18.71±1.80* 55.57±4.93＊＊

3.3 對(duì)小鼠酚紅排泌的影響 見表3。與對(duì)照組相比，念慈庵蜜煉川貝枇杷膏陽性藥物組和枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠氣管酚紅排泌量均顯著增加(P＜0.05)，提示枇杷花醇提物具有一定的祛痰作用。

表3 對(duì)小鼠酚紅排泌的影響( ± s，n=10)

表3 對(duì)小鼠酚紅排泌的影響( ± s，n=10)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1) 酚紅/(μg·mL－1)對(duì)照組 －0.34±0.08念慈庵蜜煉川貝枇杷膏組 5.4 0.48±0.11＊＊枇杷花醇提物高劑量組 4 0.46±0.08＊＊枇杷花醇提物中劑量組 2 0.44±0.06*枇杷花醇提物低劑量組 1 0.41±0.05*

3.4 對(duì)辣椒素刺激豚鼠C-纖維釋放P物質(zhì)的影響 咳嗽的產(chǎn)生與C-纖維受體接受刺激有關(guān)，C-纖維受體主要對(duì)化學(xué)刺激敏感，如辣椒素、枸櫞酸等。用小劑量的辣椒素可以使豚鼠氣管內(nèi)C-纖維P物質(zhì)釋放。表4結(jié)果顯示，模型組P物質(zhì)量與正常組相比，具有顯著性差異 (P＜0.01)，證明實(shí)驗(yàn)造模成功，辣椒素能顯著增加氣管P物質(zhì)釋放;枇杷花醇提物高劑量組和中劑量組與模型組相比能顯著減少P物質(zhì)生成 (P＜0.01)，提示，枇杷花醇提物對(duì)辣椒素致咳豚鼠氣管內(nèi)C-纖維P物質(zhì)釋放有一定抑制作用。

表4 對(duì)豚鼠肺氣管灌洗液P物質(zhì)量影響( ± s，n=7)

表4 對(duì)豚鼠肺氣管灌洗液P物質(zhì)量影響( ± s，n=7)

注:與正常組比較，*P＜0.05;與模型組比較，##P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1) P 物質(zhì)/(ng·L－1)正常組 －84.59 ±7．67模型組 － 106.88±13．43##枇杷花醇提物高劑量組 3 91.61±11．99*枇杷花醇提物中劑量組 1.5 94.87±10．44*枇杷花醇提物低劑量組0.75 102.30 ±10．11

4 討論

在研究藥物鎮(zhèn)咳作用時(shí)，多采用機(jī)械、化學(xué)和電刺激等方法刺激動(dòng)物的神經(jīng)和感受器，引發(fā)咳嗽。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)刺激法，用氨水和枸櫞酸霧化吸入，刺激副交感神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)咳嗽，結(jié)果證明枇杷花醇提物有明顯的鎮(zhèn)咳作用，各劑量組對(duì)小鼠氨水和豚鼠枸櫞酸引發(fā)的咳嗽均具有明顯的拮抗作用，枇杷花醇提物能有效抑制小鼠和豚鼠的咳嗽次數(shù)和延長咳嗽潛伏期，表明其有良好的止咳作用。P物質(zhì)是引起咳嗽不良反應(yīng)發(fā)生的重要物質(zhì)［6-7］，研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(ACE)參與P物質(zhì)等炎癥介質(zhì)的分解，當(dāng)抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶時(shí)，氣道中炎癥介質(zhì)積聚，引發(fā)咳嗽［8-10］。本實(shí)驗(yàn)采用辣椒素刺激氣道模型，觀察枇杷花醇提物對(duì)C-纖維釋放P物質(zhì)的影響，探討枇杷花醇提物的止咳機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枇杷花醇提物對(duì)C纖維-P物質(zhì)釋放有一定的抑制作用，抑制P物質(zhì)的釋放可能為枇杷花醇提物止咳作用的機(jī)制之一。

痰液是引起咳嗽的一個(gè)重要因素，氣管、支氣管和肺泡的上皮杯狀細(xì)胞、黏膜下腺體分泌呼吸道分泌液，潤滑氣道膜、保護(hù)上皮纖毛的正常生理運(yùn)動(dòng)，當(dāng)呼吸道受炎癥因子侵入時(shí)，纖毛運(yùn)動(dòng)減慢，黏膜上皮破損，黏蛋白分泌異常，最終導(dǎo)致黏液分泌增加，積累的黏液變成痰狀物質(zhì)，刺激呼吸道黏膜引起咳嗽，因此，稀釋痰液，改善呼吸道分泌物的增加，可以發(fā)揮祛痰作用［8］。本實(shí)驗(yàn)采用氣管酚紅排泌法觀察枇杷花醇提物的祛痰作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枇杷花醇提物灌胃給藥7d后，能顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量(P＜0.05)，具有明顯的祛痰作用，并提示，枇杷花醇提物通過增加呼吸道液的分泌能力，加快氣管纖毛運(yùn)動(dòng)速度，利于呼吸道分泌物咳出，達(dá)到促進(jìn)痰液的排出，減輕痰液對(duì)氣管的刺激。

［1］張 玉，王建清．枇杷的營養(yǎng)及功能成分研究進(jìn)展［J］．食品科學(xué)，2005，26(9):602-604．

［2］鄧晶晶，盧先明，蔣桂華，等．枇杷花鎮(zhèn)咳祛痰和抗炎的藥效學(xué)研究［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17(12):2469-2470．

［3］徐叔云，卞如濂，陳 修．藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］．3版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1363-1364．

［4］王靜波，楊必坤，張 宏，等．枇杷花提取物止咳作用研究［J］．中草藥，2009，40(7):1107．

［5］徐淑云．中華臨床藥物學(xué)［M］．北京;人民衛(wèi)生出版社，2003:357-9．

［6］Shigematsu S，Ishida S，Gute D C，et al．Bradykinin-induced proinflammatory signalingmechanisms［J］．Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2002，283(6):676-86．

［7］Dicpinigaitis P V．Angiotensin-converting enzyme inhibitor-induced cough:ACCP evidence-based clinical practice guidelines［J］．Chest，2006，129(1):169-73．

［8］秦 嶺，胡成平．支氣管上皮細(xì)胞在呼吸道免疫紊亂中的作用［J］．國際病理科學(xué)與臨床雜志，2010，30(14):304．

［9］葉阮健，何權(quán)瀛．血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑所致咳嗽機(jī)制研究結(jié)果的回顧分析［J］．中日友好醫(yī)院學(xué)報(bào)，2003，17(2):96-97．

［10］唐曉鴻，袁 洪，李麗軍，等．血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因IPD多態(tài)性與卡托普利［J］．中國動(dòng)脈硬化雜志，2008，16(5):377．