荷葉不同炮制品提取物對正常大鼠凝血功能影響的比較研究

彭 凱， 張學蘭， 王 莉， 李慧芬

(山東中醫(yī)藥大學，山東濟南250355)

荷葉為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn．的干燥葉，為臨床常用中藥，始載于唐· 《食療本草》。荷葉的炮制始載于唐· 《外臺秘要》的“炙”［1］，古代應用的炮制方法尚有炒令黃、炒香、炒焦、燒灰存性、焙等?，F(xiàn)代主要有煅炭［2］和炒炭法［3］，尚有酒燉法［2］。關(guān)于荷葉的炮制作用，清· 《得配本草》中明確指出荷葉“活血生用，止血炒焦用”?！吨袊幍洹?010年版載:“荷葉清暑化濕，升發(fā)清陽，涼血止血。荷葉炭收澀化瘀止血，用于多種出血證及產(chǎn)后血暈”［2］。也有認為，清熱解暑宜生用，散瘀止血宜炒炭用［4］。生荷葉現(xiàn)臨床主入降血脂和活血化瘀劑，如治高脂血癥屬痰濁挾瘀的荷丹片、治高血壓和動脈硬化的艷友茶、治高血脂癥和動脈硬化的通脈降脂片(《衛(wèi)生部頒藥品標準》)。荷葉炭主入止血劑，且以丸散劑為主，如《中國藥典》2010年版的荷葉丸及《衛(wèi)生部藥品標準》的犀角地黃丸、十灰丸、十灰散、治紅丸均含有荷葉炭。關(guān)于荷葉飲片的止血作用，目前研究仍比較薄弱，僅見有人以小鼠凝血時間為指標，對荷葉生品和煅炭品的止血作用進行比較，結(jié)果荷葉生、炭品水煎液均有止血作用，制炭后止血作用增強［5］，但荷葉不同制炭方法止血作用有何差異及其止血機理尚未見報道。本實驗比較荷葉生品、炒炭品和煅炭品醇水雙提物對正常大鼠血漿活化部分凝血活酶時間 (APTT)、凝血酶原時間 (PT)、凝血酶時間 (TT)和纖維蛋白原(FIB)水平的影響，初步探討其止血作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物 SD大鼠，雌性，體質(zhì)量 (200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號:scxk(京)2002-0003。適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 藥品與試劑 荷葉片購自山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室周鳳琴教授鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn．的干燥葉經(jīng)加工而成的絲狀片，產(chǎn)地山東。炒荷葉炭:按文獻［3］方法依法制備，得率73.8%。煅荷葉炭:按文獻［2］方法依法制備，得率70.3%。

枸櫞酸鈉，天津金匯太亞化學試劑有限公司(批號20110407);活化部分凝血活酶時間測定試劑盒 (APTT、批號20110915)、凝血酶原時間測定試劑盒 (PT、批號20110915)、凝血酶時間測定試劑盒 (TT、批號20110915)、血漿纖維蛋白原測定試劑盒 (FIB、批號20110915)，均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 AYW8000半自動凝血分析儀，南京瑞麥科技開發(fā)有限公司;LDZ4-0.8離心機，北京醫(yī)用離心機廠;78-1磁力加熱攪拌器，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.4 供試品溶液的制備 荷葉炭按臨床十灰散用量9 g計算，實驗大鼠按臨床用量20倍給藥，即3 g/kg。取炒荷葉炭粗粉90 g、煅荷葉炭粗粉90 g、荷葉片粗粉122 g(按得率計算，相當于炒荷葉炭90 g)，分別加15倍量80%乙醇，80℃加熱回流提取2次，每次1 h;合并提取液，60℃減壓回收乙醇至近干得醇提物，藥渣加15倍量水，80℃加熱回流提取1 h，提取液60℃減壓回收水至近干得醇提物;合并醇提物和水提物，加適量蒸餾水研磨混勻并稀釋至300 mL，即得質(zhì)量濃度為0.3 g/mL的混懸液，臨用前用磁力攪拌器攪勻。

2 方法與結(jié)果

2.1 大鼠分組及給藥方法 取SD大鼠32只，雌性，體質(zhì)量 (180±20)g，隨機分為4組，每組8只，分別為空白對照組 (蒸餾水組)、生荷葉醇水雙提物組、炒荷葉炭醇水雙提物組、煅荷葉炭醇水雙提物組。各供試品溶液分別按10 mL/kg的劑量灌胃，每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

2.2 APTT、PT、TT、FIB的測定［6］于第7天灌胃1 h后腹主動脈取血5mL，按9∶1比例與3.2%枸櫞酸鈉溶液混勻，以3 000 r/min離心15 min，分離血漿備用。按各指標試劑盒的要求進行APTT、PT、TT和FIB的測定，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行成組比較t檢驗及方差分析，實驗數(shù)據(jù)以ˉ± s表示，結(jié)果見表1～表2。

表1 荷葉不同炮制品提取物對正常大鼠APTT、PT、TT的影響Tab.1 Influence of differently processed Nelumbinis Folium extracts on normal rats APTT，PT，TT

表2 荷葉不同炮制品提取物對正常大鼠血漿纖維蛋白原(FIB)的影響Tab.2 Influence of differently processed Nelumbinis Folium extracts on normal rats fib level in blood plasma

研究結(jié)果表明，與空白對照組比較，生荷葉醇水雙提物可明顯縮短PT(P＜0.05)，但對APTT、TT和FIB水平無明顯影響;炒荷葉炭和煅荷葉炭醇水雙提物均可明顯縮短APTT(P＜0.001)、PT(P＜0.01)，增加FIB水平 (P＜0.05)，尤以對APTT影響最為顯著，但對TT無明顯影響;與生荷葉組比較，炒荷葉炭和煅荷葉炭醇水雙提物均能明顯縮短APTT(P＜0.001)，增加FIB水平 (P＜0.05)。

3 討論

3.1 血液凝固過程十分復雜，可分為內(nèi)源性和外源性兩個系統(tǒng)，大致可分為三個階段，即形成凝血活酶激活劑、凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶、纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白。APTT主要反映內(nèi)源性凝血途徑凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的水平［7］;PT可反映外源性凝血途徑的有關(guān)因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的水平。TT主要反映纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的時間及內(nèi)、外源共同性凝血途徑是否存在抗凝和纖溶亢進。FIB即為凝血因子Ⅰ，是通過對纖溶系統(tǒng)的影響反映凝血效果。本研究結(jié)果顯示，荷葉生、炭品均具有止血作用，經(jīng)炒炭和煅炭后止血作用增強，但不同制炭方法對荷葉炭的止血作用無明顯影響;生荷葉通過影響大鼠外源性凝血系統(tǒng)發(fā)揮止血藥效;而荷葉炭止血則通過影響大鼠內(nèi)源性、外源性凝血系統(tǒng)及纖溶系統(tǒng)共同作用所致，尤以對內(nèi)源性凝血系統(tǒng)影響更為顯著。

3.2 荷葉的制炭方法目前仍不統(tǒng)一，有炒炭和煅炭法兩種。傳統(tǒng)認為，荷葉質(zhì)地疏松，炒炭易輕揚灰化，宜采用煅炭法制炭，現(xiàn)行藥典僅收載煅炭法，但在《中國藥典》2010年版收載的“荷葉丸”及《衛(wèi)生部藥品標準》的“十灰散”中均明確規(guī)定用炒炭法制炭。前期研究發(fā)現(xiàn)，荷葉炒炭品中槲皮素、金絲桃苷量均略高于煅荷葉炭［8-9］，二者的HPLC指紋圖譜無明顯差異，且炒炭法操作簡便，藥物受熱均勻，溫度可控，荷葉炒炭時只要炒制溫度和時間適宜，并不易出現(xiàn)燃燒和灰化現(xiàn)象。而煅炭法操作復雜，只能少量加工，目前尚無適合大生產(chǎn)的悶煅設(shè)備［10］，且由于煅制時容器密封不能對藥物進行翻動，煅鍋底部宜出現(xiàn)太過現(xiàn)象，本研究結(jié)果表明，荷葉炒炭和煅炭品凝血四項指標均無明顯差異，因此認為，荷葉以炒炭法制炭為宜。

3.3 荷葉中主要含有生物堿和黃酮類成分，荷葉總生物堿具有降血脂、抑菌等作用［11-12］，荷葉總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用［13］。前期研究表明，荷葉經(jīng)炒炭和煅炭后荷葉堿損失殆盡，金絲桃苷量顯著降低，槲皮素量顯著升高［8-9］。有報道，槲皮素可顯著縮短小鼠出血和凝血時間及大鼠血漿凝血酶時間［14］。荷葉制炭后止血作用增強，分析與制炭后生物堿、黃酮類成分含量變化密切相關(guān)。荷葉制炭止血機理及荷葉炭止血藥效物質(zhì)基礎(chǔ)均有待深入研究。

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