UFLC法同時測定護(hù)肝膠囊中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素

張林林， 王永吉， 李 航， 張 輝， 孫佳明*

(1．長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林長春130117;2．長春中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)兒科，吉林長春130021)

護(hù)肝膠囊由《中國藥典》收載品種護(hù)肝片改制而來，制劑處方由柴胡、五味子等組成，具有疏肝理氣，健脾消食，降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，用于慢性肝炎、遷延性肝炎及早期肝硬化等［1］。其五味子中所含木脂素類成分與其具有抗肝臟損傷、抗氧化的作用明顯相關(guān)，故木脂素的量直接影響護(hù)肝膠囊的質(zhì)量及臨床應(yīng)用［2-6］。

目前，多是針對護(hù)肝膠囊中柴胡皂苷-α或五味子醇甲或是護(hù)肝片中五味子甲素和乙素單個有效成分測定的報道，尚未有同時對護(hù)肝膠囊中3種有效成分質(zhì)量控制方法的報道［1，7-15］。為了提升其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，采用超快速液相色譜 (ultrafast liquid chromatography，UFLC)新分析技術(shù)對護(hù)肝膠囊中的五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素3種活性成分進(jìn)行了同時測定。UFLC可實(shí)現(xiàn)高體積流量、高分辨率分析，適用于要求高通量、高效率的分析工作，在藥物分析領(lǐng)域前景廣闊［16-20］。本實(shí)驗(yàn)采用UFLC法同時測定護(hù)肝膠囊中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素3個五味子木脂素的量，以多成分指標(biāo)體系綜合評價護(hù)肝膠囊的質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 UFLC-20AD超快速液相色譜儀、PAD檢測器MB20A、LCsolution色譜工作站，日本島津公司。BP211D型十萬分之一電子天平 (德國Sartorius公司);電熱恒溫水浴鍋 (江蘇南通縣通海電器廠)。

1.2 試劑與藥品 五味子醇甲 (批號:110857-200608)、五味子甲素 (批號:110764-200107)、五味子乙素對照品 (批號:110765-200205)，均購自中國藥品生物制品檢定所，定量測定用。水為娃哈哈純凈水;除高效液相用甲醇、乙腈為色譜純，其余實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)試劑均為分析純。護(hù)肝膠囊由吉林修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。陰性對照為本實(shí)驗(yàn)室自制。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent SB C18色譜柱 (100 mm×4.6 mm，1.8μm)，體積流量0.4 mL/min;柱溫40℃;檢測波長250 nm。進(jìn)樣量2μL。

表1 UFLC同時檢測3種成分梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution requirement of simultaneous determ ination of three com ponents by UFLC

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲29.2μg、五味子甲素16.4μg、五味子乙素20.0μg的混合對照品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取護(hù)肝膠囊內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，取約0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的乙酸乙酯25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液15 mL，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過后，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方組成比例制備缺五味子陰性制劑，再按2.2.2項(xiàng)制備方法，制備五味子陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別吸取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素混合對照品溶液、護(hù)肝膠囊供試品溶液及缺五味子的陰性對照品溶液各2μL，注入超高速液相色譜儀進(jìn)行分析，結(jié)果表明陰性對照溶液在與五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素混合對照品峰相同的保留時間處無干擾峰出現(xiàn)，說明處方中其他藥味對測定結(jié)果無影響，見圖1。

圖1 對照品 (A)、護(hù)肝膠囊供試品 (B)和陰性對照(C)UFLC色譜圖Fig.1 UFLC chromatograms of m ixed reference substances(A)，Hugan Capsules sam ple(B)and negative sample w ithout Schisandrae chinensis Fructus(C)

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下的對照品溶液1、5、10、15、20μL，注入超高速液相色譜儀，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (X)，相應(yīng)的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo) (Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 3種有效成分的線性方程和線性范圍Tab.2 Linear equations and linear ranges of three components

由表2可知五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素進(jìn)樣量分別在0.029 2～0.584μg/μL、0.016～0.328 μg/μL、0.02～0.40 μg/μL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下的對照品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量為5 μL，測定峰面積值，計(jì)算五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面積的 RSD分別為0.90%、0.80%、0.80%(n=5)。試驗(yàn)表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品 (批號110901)10 mL，按2.2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣1次，考察精密度五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的RSD分別為0.60%、0.60%和0.50%(n=5)，結(jié)果供試品溶液中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素在24 h內(nèi)峰面積無明顯變化。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取護(hù)肝膠囊樣品 (批號:110901)5份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備樣品供試液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行定量測定，結(jié)果五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.21 mg/g、0.36 mg/g和0.55 mg/g，RSD分別為2.40%、2.80%、2.50%(n=5)，表明此法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 取同一批已測定的樣品 (批號110901)適量5份，每份5 mL，分別準(zhǔn)確加入對照品溶液五味子醇甲 (29.2μg/mL)14.5 mL，五味子甲素 (16.4μg/mL)8 mL，五味子乙素(20.0μg/mL)9.5 mL。按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按其2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素平均回收率 (n=5)分別為99.7%、98.5%、99.2%;RSD分別為 1.1%、2.3%、1.6%。試驗(yàn)結(jié)果表明加樣回收率良好。

2.9 樣品測定 取3批護(hù)肝膠囊 (批號分別為091103、110802、081101)，按2.1項(xiàng)色譜條件和測定方法，測定五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面積，根據(jù)多點(diǎn)外標(biāo)法計(jì)算護(hù)肝膠囊品中的3種有效成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 3批護(hù)肝膠囊樣品的測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Assay results of three batches of Hugan Capsules samp les(n=3)

根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于護(hù)肝膠囊定量測定的規(guī)定:本品每粒含五味子以五味子醇甲 (C24H32O7)計(jì)，不得少于0.28 mg;以五味子甲素 (C24H32O6)計(jì)，不得少于0.05 mg;以五味子乙素 (C23H28O6)計(jì)，不得少于0.15 mg。本實(shí)驗(yàn)采用UFLC同時測定護(hù)肝膠囊中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的量均符合規(guī)定。

3 討論

3.1 護(hù)肝膠囊中五味子具有氣陰雙補(bǔ)，養(yǎng)肝護(hù)肝之效。其中五味子醇甲、甲素和乙素為主要有效成分，因此同時測定護(hù)肝膠囊中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3種主要成分，對更好地控制護(hù)肝膠囊的內(nèi)在質(zhì)量具有重要意義。

3.2 本實(shí)驗(yàn)采用UFLC新型液相色譜技術(shù)，所用亞微米級色譜柱填充了1.8μm粒度的填料，能獲得更高的柱效，并能縮短分析時間，增加峰容量，降低柱外峰展寬效應(yīng)。在流動相的選擇上，曾采用《中國藥典》中的流動相即甲醇-水 (63∶37)。但分離效果不是很好，故選用了乙腈-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫的方法，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素均能與其它雜質(zhì)峰分離良好。

3.3 本實(shí)驗(yàn)通過方法學(xué)研究，建立了UFLC法同時測定護(hù)肝膠囊中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素3種主要成分。該方法精密度高、重現(xiàn)性好、操作簡便，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是一種高效、可行的質(zhì)量評價技術(shù)。為護(hù)肝膠囊的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

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