RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定腎康注射液中5種蒽醌類成分

徐守竹， 謝艷華， 張曉衛(wèi)， 劉媛媛， 王四旺*， 呂延英

(1．第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室，陜西西安710032;2．西安世紀(jì)盛康藥業(yè)有限公司，陜西 西安710032)

腎康注射液是由大黃、丹參、紅花、黃芪四味中藥經(jīng)現(xiàn)代工藝制備而成，具有降逆瀉濁、益氣活血之功，適用于治療慢性腎功能衰竭。中藥大黃在復(fù)方中充當(dāng)君藥，現(xiàn)代研究證實(shí)大黃蒽醌類成分在相關(guān)疾病防治過程中發(fā)揮重要作用［1］。對(duì)腎康注射液中蒽醌類成分的測(cè)定已有報(bào)道［2］，但其僅對(duì)總蒽醌成分進(jìn)行測(cè)定。因此，對(duì)腎康注射液中5種蒽醌類成分進(jìn)行定量檢測(cè)，對(duì)研究其物效基礎(chǔ)及組方原理具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)建立了一種能同時(shí)對(duì)腎康注射液中5種蒽醌類成分進(jìn)行定量測(cè)定的方法，為腎康注射液的深入研究和提高質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 島津 LC2010-AT高效液相色譜儀(Shimadzu，日本)，包括紫外可見波長(zhǎng)檢測(cè)器、柱溫箱、LC Solution色譜工作站;賽多利斯ME235S電子分析天平 (Sartorius，德國(guó));超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);水浴鍋 (北京科偉永興儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (西安太康儀器設(shè)備有限公司)。

1．2 試藥 腎康注射液 (20 mL/支，陜西西安世紀(jì)盛康藥業(yè)有限公司，批號(hào) 201206022、201201056、201203041);蘆薈大黃素對(duì)照品 (批號(hào)110706-2000436)，大黃酸對(duì)照品 (批號(hào)110756-200087)，大黃素對(duì)照品 (批號(hào) 110756-200110)，大黃酚對(duì)照品 (批號(hào) 0796-2002208)，大黃素甲醚對(duì)照品 (批號(hào)110756-0206)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;甲醇為色譜純 (Honeywell，美國(guó))，三氯甲烷、鹽酸、磷酸、乙醇 (分析純)，自制去離子水。大黃、丹參、紅花、黃芪藥材均購(gòu)于西安達(dá)仁堂中藥店，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定［3］。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Stamsil-BP C18色譜柱 (250 mm×4．6 mm，5μm);流動(dòng)相為A(甲醇)-B(0．2%磷酸水溶液)梯度洗脫，0～25 min，75% ～100%A;檢測(cè)波長(zhǎng) 440 nm;柱溫30℃;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量20μL。

2．2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品各適量于50 mL量瓶中，加甲醇超聲5 min溶解并定容。即得分別含蘆薈大黃素130μg/mL、大黃酸53．4 μg/mL、大黃素 67．6 μg/mL、大黃酚 61．6 μg/mL、大黃素甲醚54．4μg/mL的對(duì)照品溶液。

2．3 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密量取上述對(duì)照品溶液1 mL，于10 mL量瓶中，甲醇定容即得質(zhì)量濃度分別為13μg/mL、5．34μg/mL、6．76 μg/mL、6．16 μg/mL、5．44 μg/mL 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的混配溶液。

2．4 供試品溶液的制備 精密量取腎康注射液10 mL于250 mL圓底燒瓶，加8%HCl 10 mL，超聲處理5 min，加入三氯甲烷30 mL，水浴回流1 h，放冷，移置分液漏斗中 (用少量三氯甲烷多次清洗圓底燒瓶)，分取三氯甲烷層，酸液用三氯甲烷多次萃取直至無(wú)蒽醌類陽(yáng)性反應(yīng)，合并三氯甲烷，再用適量去離子水洗至中性，減壓回收三氯甲烷至干，殘?jiān)眉状既芙獠⒁浦?0mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，進(jìn)樣前用0．45μm濾過取續(xù)濾液20μL進(jìn)樣。

2．5 缺大黃陰性對(duì)照溶液的制備 取丹參、紅花、黃芪藥材適量，按腎康注射液制備方法［4］，制備缺大黃注射液，對(duì)缺大黃注射液按2．4項(xiàng)處理，即得缺大黃供試液。

2．6 大黃陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備 取大黃藥材適量，按腎康注射液制備方法制備大黃注射液，對(duì)大黃注射液的處理同2．4項(xiàng)，即得大黃注射液。

3 方法學(xué)考察

3．1 空白干擾試驗(yàn) 取缺大黃注射液進(jìn)樣20μL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陰性對(duì)照溶液對(duì)所測(cè)組分不產(chǎn)生干擾。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

3．2 線性關(guān)系考察 分別配制5種蒽醌類成分系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液 (n=7)，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定結(jié)果以質(zhì)量濃度為橫軸(X)，以相應(yīng)峰面積為縱軸 (Y)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的回歸方程 (見表1);結(jié)果表明各成分分別在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 5種蒽醌類成分的回歸方程及線性范圍Tab.1 Linear relationships and concentration ranges of the five anthraquinones

3．3 精密度考察 量取上述各對(duì)照品溶液1 mL，于10 mL量瓶中，甲醇定容到刻度，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值分別為1．16%、1．28%、1．75%、1．59%、1．71%，表明在實(shí)驗(yàn)條件下精密度良好。

3．4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液 (批號(hào):201203041)按照2．4項(xiàng)方法處理，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)峰面積。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值分別為 2．67%、2．84%、2．08、3．05%、2．49%;表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3．5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密量取腎康注射液 (批號(hào):201203041)6份，分別按照2．4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定計(jì)算得供試品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24．768 μg/mL、10．691 μg/mL、11．474 μg/mL、8．829 μg/mL、1．687 μg/mL，RSD 值 分 別 為2．01%、2．75%、2．42%、1．43%、1．55%。

3．6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取已測(cè)定的同一供試品溶液 (批號(hào):201201056)6份，每份10 mL，分別加入1 mL混合對(duì)照品溶液，按照2．4項(xiàng)下方法制備供試品溶液。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚回收率及RSD值分別為101．3% 、 1．28%， 97．9%、 2．89%， 103．7% 、2．07%，96．7%、2．76%及 102．4%、1．78%。

3．7 樣品測(cè)定 精密量取腎康注射液10 mL，按2．4項(xiàng)方法制備樣品溶液，進(jìn)樣20μL，每樣測(cè)定5次。結(jié)果見表2。

表2 5種蒽醌類成分的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determ ination results of the five anthraquinones

4 討論

4．1 腎康注射液中5種蒽醌類成分的量為蘆薈大黃素＞大黃素＞大黃酸＞大黃酚＞大黃素甲醚?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)大黃蒽醌類成分在防治腎臟疾病中發(fā)揮重要作用，尤其大黃酸［5-7］和大黃素［8-9］的報(bào)道頗多。開展腎康注射液中物效基礎(chǔ)研究對(duì)將其開發(fā)為高效、低毒、成分明確的現(xiàn)代中藥即“分子中藥”［10］具有重要意義。

4．2 大黃蒽醌類成分的提取工藝已比較成熟，本實(shí)驗(yàn)在崔紅花等［11］研究基礎(chǔ)上，分別用超聲法、加熱回流法和索氏提取法對(duì)腎康注射液進(jìn)行提取，最終確定處理方法2．4項(xiàng)操作簡(jiǎn)單，成分得率高。

4．3 流動(dòng)相選擇時(shí)，考慮蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的極性較小，宜采用有機(jī)相比例較大的流動(dòng)相，這5種成分都含有酚羥基略顯酸性，故加入酸以抑制拖尾現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)分別考察了0．1%、0．2%、0．5%磷酸及乙酸，結(jié)果顯示0．2%以上上述2種酸，峰形良好且磷酸略優(yōu)于乙酸，故選擇0．2%的磷酸水作為B相。同樣考察了有機(jī)相甲醇及乙腈，兩者都能較好地分離各成分，但是甲醇比乙腈經(jīng)濟(jì)，故選甲醇為A相。在此梯度下各峰分離度好，干擾小，出峰時(shí)間適中。

4．4 色譜柱的選擇時(shí)，根據(jù)上述流動(dòng)相考察了Yilite Hypersil BDSC18色譜柱 (250 mm ×4．6 mm，5 μm)、Ultamate AQ C18色譜柱 (250 mm × 4．6 mm，5μm)、Phenomenex Lnna C18色譜柱 (250 mm ×4．6 mm，5 μm)、Stamsil-BPC18色譜柱 (250 mm×4．6 mm，5μm)。各種色譜柱對(duì)各峰的分離度及峰形影響較小，唯獨(dú)出峰時(shí)間略有變化。

4．5 其他色譜條件選擇時(shí)，在Waters 2695 HPLCDAD，預(yù)試實(shí)驗(yàn)中，全波長(zhǎng)掃描顯示在440 nm下峰形良好，基線平穩(wěn)，干擾成分少，故選擇440 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。體積流量、柱溫等條件對(duì)定量測(cè)定影響較小。

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