HPLC法同時測定胃復春片中藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素

蔣慧蓮， 祝 明， 陳 勇， 李文庭

(1.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江杭州310053;2.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州310004)

胃復春片具有健脾益氣、活血解毒之功效，其主要組成為紅參、香茶菜、枳殼［1］。臨床上胃復春片用于胃癌前期以及慢性胃炎的治療，胃復春片系純中藥制劑，長期使用安全可靠，毒副作用小，是治療慢性萎縮性胃炎比較理想的藥物［2-6］。香茶菜目前的標準多為地方標準，而各地的標準中對香茶菜的基源規(guī)定差異較大。經(jīng)調(diào)研，目前市場上香茶菜實際流通與使用較多的為安徽及河南產(chǎn)的香茶菜，主要品種為藍萼香茶菜。藍萼香茶菜Rabdosia japonica(Burm．f．)Hara var．Glaucocalyx(Maxim．)Hara為唇形科植物，具有健胃消食、清熱解毒、活血等作用及抗菌、抗癌和抗腫瘤等生物活性［7-12］。藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素均為藍萼香茶菜的主要成分［13］，目前尚未有報道對胃復春片中香茶菜的相關(guān)成分進行測定，而香茶菜作為胃復春片的主要成分，為了更好地對胃復春片的質(zhì)量進行控制，作者對胃復春片中香茶菜主要成分藍萼甲素、乙素、丁素進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20A高效液相色譜儀 (日本島津);METILER AE240型電子天平。

1.2 試劑與試藥 對照品:藍萼甲素、藍萼乙素及藍萼丁素均為自制，純度＞99%。樣品:胃復春片10批，杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。甲醇、乙腈均為色譜純;水為重蒸水;其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為乙腈 (A)-甲醇(B)-水 (C)梯度洗脫，0～18 min，24%A，5%B，71%C;18～45 min，24% ～10%A，5%～50%B，71% ～40%C;45 min～51 min，10%～80%A，50% ～5%B，40% ～15%C;51 min～53 min，80% ～24%A，5%B，5% ～71%C;53 min～60 min，24%A，5%B，71%C;體積流量1 mL/min;檢測波長232 nm;柱溫30℃;進樣量10μL，標準曲線法。對照品及供試品色譜圖見圖1。

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素適量，加70%甲醇配置成質(zhì)量濃度為48.68、32.96、30.56μg/mL的對照品溶液。

圖1 胃復春片HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of W eifuchun Tablets

2.3 供試品溶液的制備 取樣品 (批號1111247)適量，研細，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液25 mL，蒸干，加水15 mL溶解，用三氯甲烷振搖提取4次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，加甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4 測定方法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測定，計算，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密稱取藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素適量，加70%甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為97.36、65.92、61.12μg/mL的混合對照溶液，精密量取0.5、1、2、3、5、10、15、20、25μL，注入液相色譜儀，以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標，進樣量 (X，ng)為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。結(jié)果表明藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素在實驗質(zhì)量濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。見表1。

表1 藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素的線性關(guān)系Tab.1 Linearity of glaucocalyxin A，glaucocalyxin B and glaucocalyxin D

2.6 精密度試驗 取混合對照溶液按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6針，記錄對照品峰面積，藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素峰面積RSD分別為0.3%、0.3%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取胃復春片供試品 (批號1111247)按2.3項下方法制備供試品溶液，在0、2、4、8、12、18、24 h進樣測量峰面積，結(jié)果藍萼甲素、藍萼乙素及藍萼丁素的峰面積RSD分別為1.2%、0.3%及0.1%，表明供試樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 取胃復春片供試品 (批號1111247)，按2.3項下方法同時制備6份供試品溶液進行測定，藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素的含有量RSD分別為1.2%、1.8%及1.8%，表明本方法重復性良好。

2.9 專屬性試驗 按胃復春片制備工藝及2.3項下供試品制備方法制備缺香茶菜的陰性樣品溶液，以2.1項下色譜條件進行測定，結(jié)果藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素均未檢測出。見圖1。

2.10 加樣回收率 稱取已測定的供試品 (批號1111247)約0.5 g，共6份，分別加入適量藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素的混合對照品，按2.3項下方法制備供試品溶液。在2.1項色譜條件下進樣10μL，計算加樣回收率。見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.2 Resu lts of recoveries(n=6)

2.11 樣品測定 取10批供試品，按2.3項下供試品制備方法制備供試液并測得藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素的質(zhì)量分數(shù)分別為0.31～1.01 mg/g、0.26 ～1.14 mg/g、0.24 ～0.96 mg/g。見表3。

表3 胃復春片中藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Contents of glaucocalyxin A，glaucocalyxin B and glaucocalyxin D in Weifuchun Tablets(n=3)

3 討論

3.1 曾嘗試用70%甲醇、乙醇、70%乙醇進行提取，結(jié)果效果均未有甲醇提取好，因此確定使用甲醇作為提取溶劑。超聲時間15 min、30 min、45 min以及60 min比較，結(jié)果15 min的時候未提取完全，而45 min和60 min的提取效果和30 min相近，因此選擇超聲30 min進行提取。選擇萃取溶劑時，對乙酸乙酯、三氯甲烷以及乙醚做比較，結(jié)果乙酸乙酯萃取后雜質(zhì)較多，乙醚萃取效果較差，三氯甲烷萃取效果最佳，雜質(zhì)少，因此選用三氯甲烷作為萃取溶劑。

3.2 曾嘗試以乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇-水以一定比例進行等度洗脫，結(jié)果雜質(zhì)干擾較嚴重，且未能將藍萼甲素、藍萼乙素以及藍萼丁素進行較好分離，最后考慮使用乙腈-甲醇-水進行梯度洗脫，將3個物質(zhì)進行了較好分離。

3.3 曾將色譜條件中的色譜柱換成SB C18柱以及月旭C18柱進行考察，體積流量也以0.9mL/min和1.1 mL/min的體積流量與本方法進行了比較，柱溫考察了25℃以及40℃，結(jié)果表明藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素均能較好分離，而且不同色譜條件下含有量差異均在0.5%以內(nèi)，表明本方法耐用性良好。

3.4 從10批胃復春片測定結(jié)果看，樣品中均含有藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素，說明胃復春片現(xiàn)基本以藍萼香茶菜作香茶菜投料，從測定結(jié)果來看，不同批次樣品藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素的含有量差異較大，因此有必要對其進行質(zhì)量控制。而本方法對藍萼甲素、藍萼乙素、藍萼丁素進行測定準確度高，耐用性好，能作為控制胃復春片質(zhì)量的方法。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版 一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:883．

［2］雷永其．胃復春片用于治療慢性萎縮性胃炎152例［J］．甘肅中醫(yī)，2010，23(8):39-40．

［3］周國標．胃復春片治療慢性萎縮性胃炎100例報道［J］．浙江臨床醫(yī)學，2006，8(9):976．

［4］周建莉．胃復春片治療慢性萎縮性胃炎112例［J］．實用中醫(yī)藥雜志，2004，20(6):316．

［5］王坤根．胃復春片治療慢性胃炎療效觀察［J］．浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，14(6):365-366．

［6］馬 寧，鹿凡存，馬巧玲．胃復春片對慢性胃炎的治療作用［J］．山東醫(yī)藥工業(yè)，2002，21(2):50-51．

［7］高長久，于雙雙，梁啟超．藍萼香茶菜研究新進展［J］．牡丹江醫(yī)學院學報，2011，32(1):54-56．

［8］宿 玉，崔 佳，施務務，等．中藥香茶菜研究進展［J］．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(6):155-158．

［9］周文蘭，李水福．香茶菜類藥的研發(fā)［J］．中國藥業(yè)，2010，19(6):58-59．

［10］馬占強，王 敏，張 健，等．藍萼甲素抗凝血作用研究［J］．云南中醫(yī)學院學報，2011，34(3):26-29．

［11］沈曉丹，曹 莉，董 霞，等．藍萼甲素體外細胞毒活性研究［J］．中華中醫(yī)藥學刊，2011，29(6):1334-1335．

［12］董瑞華，高洪志，劉澤源．唇形科香茶菜屬二萜類化合物生物活性研究進展［J］．中國藥房，2010，21(7):651-653．

［13］桂明玉，金永日，劉松艷，等．藍萼香茶菜化學成分研究Ⅱ［J］．中國藥學雜志，2000，35(6):374-375．