大柴胡顆粒質量標準研究

胡穎菲， 陸兔林*， 毛春芹， 吳 皓， 弓曉東， 周云中， 王 菊， 張 星

(1．南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京210046;2．南通精華制藥股份有限公司，江蘇南通226005)

大柴胡顆粒，是在東漢著名醫(yī)學家張仲景創(chuàng)立的“大柴胡湯”的基礎上，根據現代制劑工藝制備的顆粒劑，由柴胡、黃芩、大黃、枳實 (炒)、芍藥、半夏 (姜)、生姜、大棗八味藥材組成，具有和解少陽、內瀉熱結之功效，臨床主要用于急慢性膽囊炎的治療［1］。柴胡為方中君藥，黃芩、枳實、大黃共為臣藥，主要活性成分包括黃酮類、萜類、皂苷、蒽醌和香豆素等，其中以枳實與黃芩中的黃酮類成分 (柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷等)量最高。目前有關大柴胡顆粒的質量標準研究尚未見報道，僅見對黃芩苷進行定量檢測分析［2］。因此，本實驗采用薄層色譜法 (TLC)對黃芩、大黃、枳實、白芍進行定性鑒別，高效液相色譜法(HPLC)同時測定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷，為全面有效控制大柴胡顆粒的質量提供科學依據。

1 儀器與材料

Agilent1200高效液相色譜儀 (G1315C DAD檢測器)，Chem Station色譜工作站;KQ-500B型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);AB104-L分析天平 (德國梅特勒公司);HH-S型水浴鍋 (鞏義市英峪予華儀器廠);硅膠G、H薄層板 (青島海洋化工廠);紫外分析儀WD-9403C型 (北京市六一儀器廠)。

柚皮苷對照品 (批號110722-201111)、橙皮苷對照品 (批號110721-200905)、新橙皮苷對照品 (批號111857-201102)、黃芩苷對照品 (批號110715-201014)、黃芩對照藥材 (批號 120955-201008)、大黃對照藥材 (掌葉大黃，批號121249-201003)、枳實對照藥材 (批號 120936-201005)、白芍對照藥材 (批號120905-201109)均購自中國藥品生物制品檢定所;大柴胡顆粒樣品及處方藥材 (江蘇南通精華制藥有限公司提供);乙腈 (美國Tedia公司)、甲醇 (上海凌峰化學試劑公司)為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜 (TLC)鑒別

2.1.1 黃芩的 TLC鑒別［3］取本品2 g，研細，加甲醇40 mL，超聲20 min，濾過，濾液揮干，殘渣加水50 mL使溶解，離心 (4 800 r/min，15 min)傾出上清液，鹽酸調pH 1～2，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，殘渣用甲醇定容至1 mL，作為供試品溶液。另取黃芩對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取缺黃芩的陰性樣品2 g，同法制成陰性對照溶液。吸取上述溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 (10∶3∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。黃芩的薄層色譜圖見圖1。

圖1 黃芩TLC色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Scutellariae Radix

2.1.2 大黃的 TLC鑒別［4-5］取本品0.5 g，研細，加甲醇20 mL，超聲10 min，濾過，取濾液5 mL，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用三氯甲烷分2次振搖萃取，每次20 mL，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。再取缺大黃的陰性樣品0.5 g，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法 (附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述3種溶液各4μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以石油醚 (30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸 (15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈 (365 nm)下檢視。供試品色譜中，結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯橙黃色熒光斑點，陰性對照無干擾。大黃的薄層色譜圖見圖2。

圖2 大黃TLC色圖譜Fig.2 TLC chromatogram of Rhei Radix et Rhizoma

2.1.3 枳實的 TLC鑒別［6］取本品2 g，研細，加甲醇20 mL，密塞，超聲20 min，濾過，取濾液10 mL，蒸干，殘渣加甲醇2 mL作為供試品溶液。另取枳實對照藥材，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的混合溶液，作為對照品溶液。再取缺枳實的陰性樣品2 g，同法制成陰性對照溶液。分別吸取上述溶液各10μL，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水 (20∶10∶1∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈 (365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。枳實的薄層色譜圖見圖3。

圖3 枳實TLC色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of Aurantii Fructus immaturus

2.1.4 白芍的TLC鑒別［7］取本品1.5 g，研細，加70%甲醇20 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取白芍對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。再取缺白芍陰性樣品1.5 g，同法制成陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯(8∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。白芍的薄層色譜圖見圖4。

圖4 白芍TLC色譜圖Fig.4 TLC chromatogram of Paeoniae Radix alba

2.2 黃酮類成分 (黃芩苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷)HPLC定量測定［8-12］

2.2.1 色譜條件 漢邦Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6mm，5μm)，乙腈 (A) －0.2%醋酸水溶液 (B)為流動相梯度洗脫，0 min(5%A)，28 min(26%A)，36 min(26%A)，48 min(40%A)，體積流量為1 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫為30℃，進樣量10μL，理論塔板數按柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷計算均不低于4 000。

2.2.2 對照品溶液的配制 分別稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷對照品適量，精密稱定，置2mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。分別精密量取單個組分對照品溶液，加甲醇配成每1 mL分別含柚皮苷0.193 8 mg、橙皮苷0.109 6 mg、新橙皮苷0.128 7 mg、黃芩苷0.452 5 mg的混合對照品液。

2.2.3 供試品溶液的配制 取大柴胡顆粒適量，研細，精密稱取1.00 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，再稱定質量，加甲醇補足損失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，用時過0.45μm的濾膜。

2.2.4 陰性對照溶液配制 按處方比例分別稱取除黃芩、枳實以外的其余藥味，按照制備工藝制成缺黃芩、缺枳實、同時缺黃芩和枳實的陰性樣品，按2.2.3項供試品溶液的制備方法操作，制成陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液，供試品溶液及陰性供試品溶液，按上述色譜條件進樣分析，液相色譜圖見圖5。陰性樣品在指標成分柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的色譜峰位置上無吸收，表明該方法的專屬性良好。

圖5 大柴胡顆粒的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram s of Dachaihu Granules

2.2.6 線性關系考察 分別精密吸取2.2.2項下的混合對照品溶液1、2、5、10、15、20μL進樣分析，記錄峰面積。以峰面積Y對進樣量X(μg)進行線性回歸，求得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的回歸方程、相關系數和線性范圍，結果見表1。

表1 4種有效成分的線性方程、相關系數及線性范圍Tab.1 Regression equations，correlation coefficients and linearity ranges of four compounds

2.2.7 精密度試驗 取上述對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，計算柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷的峰面積，其RSD分別為0.80%、0.89%、0.79%、1.44%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取批號為110801的大柴胡顆粒樣品1份，按照供試品溶液的制備方法制備供試品液，分別在0、2、4、8、12、20 h測定樣品中各組分的峰面積，測得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷峰面積的RSD分別為1.32%、1.19%、1.68%、1.15%，表明供試品溶液在20 h內穩(wěn)定。

2.2.9 重復性試驗 取批號為110801的大柴胡顆粒樣品6份，每份1.00 g，按照供試品溶液的制備方法制備供試品液，進樣10μL，記錄峰面積，并計算質量分數。結果樣品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷平均質量分數 (n=6)分別為5.764 2 mg/g、 2.907 4 mg/g、 3.422 2 mg/g、16.523 2 mg/g，RSD分別為 1.50%、2.39%、1.93%、2.78%，表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 稱取批號為110801的大柴胡顆粒樣品9份，每份約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入低、中、高3個質量濃度的混合對照品溶液 (含柚皮苷2.882 3 mg/mL、橙皮苷1.456 1 mg/mL、新橙皮苷1.702 8 mg/mL、黃芩苷8.262 4 mg/mL)0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率，結果見表2。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及黃芩苷的平均回收率分別為99.94%、95.83%、97.46% 和 98.94%，RSD 分 別 為1.89%、1.72%、2.21%和2.68%。

表2 大柴胡顆粒中4種成分加樣回收率(n=9)Tab.2 Recoveries of four com pounds in Dachaihu Granules(n=9)

2.2.11 樣品測定 取不同批號的大柴胡顆粒，按2.2.3項下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定質量分數，結果見表3。

表3 大柴胡顆粒4種成分的測定結果(n=3)Tab.3 Contents of four com pounds in Dachaihu Granules(n=3)

3 討論

一般質量標準研究，主要是選擇方中一到兩個主要成分進行定量分析。本實驗選擇柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黃芩苷作為大柴胡顆粒的定量指標，有以下幾個原因。這4種成分均是黃酮類物質，在280 nm附近有最大吸收，同一色譜條件下能很好地分離;同時，方中君藥柴胡中的柴胡皂苷量極低，且不易檢測;柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷是枳實中最主要的活性成分，黃芩苷是黃芩中量最高的活性物質，故選擇臣藥黃芩、枳實中的主要成分作為大柴胡顆粒的定量指標。4種黃酮類成分同時定量檢測對于控制大柴胡顆粒的質量有著重要意義。

本實驗考察了不同提取溶劑如水、95%乙醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇，結果以甲醇提取較完全。比較了超聲提取和回流提取，發(fā)現兩者提取效果相當，因超聲提取簡單、節(jié)省時間，故選擇超聲提取法。對提取時間 (30 min、40 min、50 min)進行比較，發(fā)現30 min即可提取完全。同時，比較了多種流動相系統(tǒng)，包括甲醇-水、乙腈-水、乙腈-醋酸水系統(tǒng)，結果表明甲醇-水體系基線漂移，乙腈-水體系基線平穩(wěn)，各峰分離度較好，但黃芩苷未見出峰，乙腈-醋酸水系統(tǒng)各峰分離較好。又考察了乙腈-0.05%醋酸水、乙腈-0.1%醋酸水、乙腈-0.2%醋酸水3個流動相體系，結果以乙腈-0.2%醋酸水為流動相各成分峰形較好，各峰間的分離度均達到1.5以上。故選擇流動相為乙腈-0.2%醋酸水梯度洗脫。

［1］張振中，李 美．大柴胡顆粒治療老年慢性膽囊炎的臨床觀察［J］．國際消化病雜志，2011，31(3):183-184．

［2］劉 博，楊向東，史自東．HPLC法測定大柴胡顆粒中黃芩苷含量［J］．湖北中醫(yī)雜志，2007，29(5):51-52．

［3］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:283．

［4］劉友平，宋 英，秦春梅，等．枳實導滯濃縮丸質量標準研究［J］．中國中藥雜志，2002，27(11):838-840．

［5］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:22．

［6］劉振華，何麗果，徐艷霞，等．枳實消痞丸的薄層色譜鑒別［J］．藥物鑒定，2010，19(10):48．

［7］楊婉花，郝曉靜，李 娟，等．雙白片質量標準研究［J］．中國藥房，2010，21(27):2549-2551．

［8］許麗娜，韓 旭，丑小華，等．反相HPLC法同時測定大柴胡湯中3種黃酮類的含量［J］．藥物分析雜志，2008，28(10):1686-1688．

［9］徐海燕，金 藝，張紅霞，等．HPLC同時測定胃動力片中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量［J］．中成藥，2010，32(8):1355-1357．

［10］郭麗紅，鄭國鈞，苗愛東，等．高效液相色譜法測定劫鏢清肺丸中柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷的含量［J］．藥物分析雜志，2009，29(9):1493-1495．

［11］謝友良，曾慧芳，林 吉，等．HPLC測定黃芩正氣膠囊中橙皮苷、黃芩苷、和厚樸酚、厚樸酚的含量［J］．中成藥，2006，28(1):34-36．

［12］于 穎．HPLC測定木香理氣丸中黃芩苷和橙皮苷含量［J］．中成藥，2004，26(10):810-812．