防己茯苓湯抗炎組分篩選及其機(jī)制分析

潘一峰， 楊曉露， 劉 朵， 章丹丹*

(1.上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥股份有限公司，上海200050;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心，上海201203)

防己茯苓湯出自張仲景所著《金匱要略》之水氣病脈證篇:防己、黃芪、桂枝各三兩，茯苓六兩，甘草二兩，以上五味，以水六升，炙取二升，分溫三服。具有益氣健脾，溫陽利水的功效［1］?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用廣泛，主要用于治療慢性腎炎水腫、心臟病水腫、肝硬化腹水等水腫類疾病，還可輔助治療慢性胃炎、慢性結(jié)腸炎、慢性滑膜炎等［2-4］。其在多種動物模型上呈抗炎效果，能抑制二甲苯致小鼠耳腫脹和大鼠蛋清性足腫脹，抑制大鼠棉球性肉芽增生，降低大鼠毛細(xì)血管通透性，降低角叉菜致大鼠趾腫組織中的前列腺素含量［5］。但其抗炎的活性組分及其分子機(jī)制尚未完全確定和闡明。

本實(shí)驗(yàn)利用水煎和乙醇提取分別獲得防己茯苓湯水或醇提取物和組成方劑的單味藥醇提取物，再利用有機(jī)溶劑萃取將方劑粗提取物分成極性不同的組分，以激活巨噬細(xì)胞中亞硝酸鹽形成的影響為篩選指標(biāo)，對篩選獲得的活性組分進(jìn)行機(jī)制分析，包括炎癥中關(guān)鍵酶類誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase，iNOS)、環(huán)氧合酶 (cyclooxygenase-2，COX-2)的蛋白表達(dá)及總抗氧化能力的測定評價(jià)。

1 材料

1.1 藥物提取物及組分的制備

1.1.1 藥材 均購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?。

1.1.2 水提取物及其組分制備 防己90 g、黃芪90 g、桂枝90 g、茯苓180 g、甘草60 g，打粉混合，水煎煮，提取3次，濾液濃縮干燥后得浸膏(79.04 g)，分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇依次萃取3次，得石油醚組分、乙酸乙酯組分、正丁醇組分和萃后水溶性組分。

1.1.3 乙醇提取物及其組分制備 藥材和劑量同上，打粉混合，用70%乙醇，80℃，提取3次，濾液濃縮和冷凍干燥后得浸膏 (59.28 g)，分散于水中，石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇依次萃取3次，得石油醚組分、乙酸乙酯組分、正丁醇組分和萃后水溶性組分。

1.1.4 單味藥醇提取物制備 取以上5種單味藥各100 g分別打粉，提取 (70%乙醇，80℃)3次，合并濾液和冷凍干燥后得浸膏即為單味藥乙醇提取物。

以上提取物及組分用DMSO配成200 mg/mL溶液，－80℃保存，臨用前稀釋成所需濃度，DMSO終質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜0.1%。

1.2 藥物與試劑 RAW264.7細(xì)胞購自ATCC公司;RPMI 1640、胎牛血清，購自Gibco公司。二甲基亞砜 (DMSO)、脂多糖 (LPS)、噻唑藍(lán)(MTT)、Griess反應(yīng)試劑，水溶性維生素 E(Trolox)、TPTZ均購自Sigma公司;蛋白含量測定試劑購自碧云天公司;PVDF膜購自Bio-rad公司;鼠重組干擾素 (IFN-γ)，購自Millpore公司。蛋白梯度對照品，購自Progema公司;iNOS、COX-2、β-actin抗體和二抗購自Cell Signaling Technology公司和Santa Cruz公司。ECL檢測試劑購自GE公司。其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Spectra MAX190酶標(biāo)儀，美國MD公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;單向電泳系統(tǒng)，美國 Bio-rad公司;sMPIC2600C自動X線膠片洗片機(jī)，上海申貝公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW 264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱中，在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天傳代，取生長對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 基于細(xì)胞炎癥模型的體外篩選［6］細(xì)胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)過夜。空白對照組采用含0.1%DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)細(xì)胞，模型組采用脂多糖 (100μg/L)和IFN-γ(1×104U/L)協(xié)同刺激細(xì)胞，給藥組用防己茯苓湯乙醇提取物、水提物、來源于醇或水提物的乙酸乙酯組分、正丁醇組分、萃后水組分、單味藥乙醇提取物分別以200、100、50、10μg/mL 4個劑量處理細(xì)胞。同時(shí)加入誘導(dǎo)劑并培養(yǎng)24 h后，吸取上清培養(yǎng)液100μL，加入100μL的Griess反應(yīng)液，室溫反應(yīng)10 min，于540 nm處讀取光吸收值。計(jì)算給藥組對細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽積累的抑制率。抑制率 (%)=(模型組吸光值－給藥組各劑量吸光值)/(模型組吸光值－空白對照組吸光值)×100%。

2.3 考察乙醇－乙酸乙酯提取組分干預(yù)前后對激活和靜息巨噬細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽產(chǎn)量的變化［7］細(xì)胞分組同前，其中給藥組為乙醇－乙酸乙酯提取組分20、40、60μg/mL 3個劑量處理激活和靜息細(xì)胞。加刺激劑或不加刺激劑維持24 h培養(yǎng)后，Griess法測定各組吸光值并計(jì)算乙醇－乙酸乙酯提取組分各劑量對激活或靜息態(tài)細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽產(chǎn)量的影響。

2.4 考察乙醇－乙酸乙酯提取組分和單味藥乙醇提取物對激活或靜息態(tài)細(xì)胞增殖能力的影響［8］激活態(tài)細(xì)胞的誘導(dǎo)處理和分組同上，靜息細(xì)胞設(shè)空白對照組、乙醇－乙酸乙酯提取組分3個劑量處理組、單味藥乙醇提取物4個劑量處理組，吸取上清液100μL后，加入MTT溶液 (PBS溶解，5 mg/mL)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，加入DMSO150μL，于490 nm讀取吸光值，以空白對照組的細(xì)胞活力為100%對照，計(jì)算乙醇－乙酸乙酯提取組分各劑量對激活和靜息細(xì)胞增殖能力以及單味藥醇提取物對靜息巨噬細(xì)胞活力的影響。

2.5 三價(jià)鐵還原抗氧化能力FRAP法［9］測定乙醇－乙酸乙酯提取組分的總抗氧化能力 空白對照組為等量的PBS溶液，標(biāo)準(zhǔn)對照組為1 mol/L Trolox，EAFD處理組為100、200、400μg/mL 3個劑量，245μL新鮮配制的FRAP溶液［0.3mol/L醋酸鹽緩沖液∶10mmol/L TPTZ∶20mmol/L FeCl3以10∶1∶1(V/V)混合］，加入5μL各組樣品，靜置10 min后，593 nm測定對還原Fe3+的能力。以PBS值讀數(shù)為本底值，各組抗氧化值用各組吸光值以本底值調(diào)零后，與1 mol/L Trolox的吸光值比值來表示。

2.6 Western blot檢測乙醇－乙酸乙酯提取組分對iNOS和COX-2蛋白表達(dá) 細(xì)胞接種于30 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜。分組同上，乙醇－乙酸乙酯提取組分采用20、40、60μg/mL 3個劑量預(yù)處理1 h后，加入刺激劑，共同孵育6 h后，收集蛋白上清液進(jìn)行蛋白量測定。每孔加入50μg的蛋白上樣，在7.5%和10%的SDS-PAGE凝膠中電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，10%脫脂牛奶封閉，分別用一抗iNOS(1 ∶1 000)、COX-2(1 ∶1 000)、β-actin(1∶800)與膜4℃孵育過夜，PBST溶液洗膜3×15 min，IgG-HRP二抗 (1∶2 000～1∶5 000)與膜孵育1 h，PBST溶液洗膜3×15 min，膜控干后加ECL試劑，進(jìn)行顯影、定影。

3 結(jié)果

3.1 防己茯苓湯醇水提取物及其組分、單味藥乙醇提取物對激活巨噬細(xì)胞上清液亞硝酸鹽量的影響

方劑中的單味藥除黃芪外其它藥味均能抑制激活巨噬細(xì)胞中亞硝酸鹽含量，以IC50從低到高排序?yàn)?防己 (30.18μg/mL) ＜甘草(41.92μg/mL)＜茯苓 (54.01μg/mL) ＜桂枝 (71.72μg/mL)。具有抑制的活性組分有水提乙酸乙酯組分，乙醇－石油醚組分，乙醇－乙酸乙酯組分，IC50分別為61.80、44.22、21.00μg/mL，以乙醇 －乙酸乙酯提取組分抑制效果最強(qiáng)，其IC50最低，強(qiáng)于各單味藥乙醇提取物對亞硝酸鹽的抑制效果 (表1)。

表1 防己茯苓湯提取物及其組分、單味藥醇提取物對激活巨噬細(xì)胞上清液亞硝酸鹽的影響( ± s，n=6)Tab.1 Nitrite accumulation of sam ples on stimulated macrophages( ± s，n=6)

表1 防己茯苓湯提取物及其組分、單味藥醇提取物對激活巨噬細(xì)胞上清液亞硝酸鹽的影響( ± s，n=6)Tab.1 Nitrite accumulation of sam ples on stimulated macrophages( ± s，n=6)

分組 劑量/(μg·mL－1)亞硝酸鹽/(μmol·L－1) 抑制率/% 得率/% 分組 劑量/(μg·mL－1)亞硝酸鹽/(μmol·L－1) 抑制率/% 得率/%對照組 8.69±0.07 －模型組 76.83±0.02 －水提取物 200 80.67±0.01 0 15.50 100 78.93±0.02 0 50 80.37±0.02 0 10 77.67±0.02 0水-石油醚組分 200 68.95±0.02 11.57 0.06 100 75.86±0.02 1.43 50 77.20±0.03 0 10 80.04±0.05 0水-乙酸乙酯組分 200 11.23±0.01 96.27 1.82 100 10.09±0.00 97.96 50 36.23±0.01 59.59 10 78.07±0.01 0水-正丁醇組分 200 69.06±0.02 11.41 0.92 100 74.34±0.01 3.66 50 74.42±0.01 3.54 10 77.90±0.01 0水-萃后水組分 200 77.47±0.01 0 6.17 100 81.23±0.02 0 50 73.92±0.02 4.28 10 72.51±0.02 6.35乙醇提取物 200 63.85±0.02 19.06 11.62 100 69.49±0.01 10.78 50 62.71±0.02 20.72 10 73.07±0.01 5.53乙醇-石油醚組分 200 14.24±0.00 91.86 0.57 100 11.52±0.00 95.85 50 39.98±0.02 54.09 10 74.98±0.01 2.72乙醇-乙酸乙酯組分 200 11.94±0.01 95.24 3.17 100 11.00±0.01 96.61 50 11.74±0.00 95.53 10 69.75±0.01 10.39醇-正丁醇組分 200 58.39±0.01 27.07 4.99 100 68.67±0.01 11.97 50 71.79±0.02 7.40 10 72.88±0.01 5.81醇-萃后水相組分 200 75.29±0.00 2.26 19.23 100 75.48±0.02 1.98 50 73.78±0.03 4.48 10 74.00±0.02 4.16防己 200 4.55±0.02 97.25 11.03 100 4.28±0.01 98.11 50 24.86±0.04 33.65 10 31.08±0.04 14.17茯苓 200 9.44±0.01 88.02 2.21 100 26.69±0.04 56.75 50 42.99±0.05 27.20 10 44.49±0.08 24.48黃芪 200 57.01±0.02 16.40 47.06 100 58.52±0.01 13.96 50 60.54±0.02 10.71 10 62.68±0.01 7.24桂枝 200 14.18±0.01 72.04 9.32 100 26.02±0.02 38.43 50 24.10±0.04 43.87 10 27.34±0.03 34.68甘草 200 6.07±0.01 98.51 36.62 100 25.86±0.01 66.62 50 40.76±0.01 42.59 10 61.42±0.02 9.29

3.2 防己茯苓湯單味藥乙醇提取物對靜息巨噬細(xì)胞增殖能力的影響 防己和茯苓乙醇提取物在高劑量對靜息巨噬細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性，黃芪乙醇提取物各劑量對巨噬細(xì)胞的增殖無影響，桂枝、甘草乙醇提取物在其抗炎IC50劑量50、100μg/mL對巨噬細(xì)胞活力無影響 (表2)。

表2 防己茯苓湯單味藥乙醇提取物對靜息巨噬細(xì)胞增殖能力的影響( ± s，n=6)Tab.2 Effects of cell proliferation of ethanol extract of single herb on resting macrophages(n=6)

表2 防己茯苓湯單味藥乙醇提取物對靜息巨噬細(xì)胞增殖能力的影響( ± s，n=6)Tab.2 Effects of cell proliferation of ethanol extract of single herb on resting macrophages(n=6)

分組 劑量/(μg·mL－1)靜息巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力/%對照組 －100.00±0.10模型組 － －防己乙醇提取物 200 9.45±0.01 100 7.63±0.01 50 56.76±0.01 10 102.97±0.01茯苓乙醇提取物 200 9.30±0.01 100 49.13±0.03 50 51.84±0.04 10 101.66±0.03黃芪乙醇提取物 200 100.98±0.01 100 93.30±0.01 50 97.87±0.01 10 99.77±0.01桂枝乙醇提取物 200 85.32±0.01 100 107.18±0.01 50 105.46±0.01 10 98.30±0.01甘草乙醇提取物 200 43.92±0.01 100 110.30±0.01 50 121.60±0.01 10 107.66±0.01

3.3 防己茯苓湯乙醇－乙酸乙脂提取組分對激活和靜息態(tài)巨噬細(xì)胞中亞硝酸鹽和增殖能力的影響防己茯苓湯乙醇－乙酸乙脂組分呈劑量依賴性抑制激活細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽量，對靜息巨噬細(xì)胞中亞硝酸鹽的量無影響;能提升炎癥損傷后的細(xì)胞活力，對靜息巨噬細(xì)胞具有促增殖作用 (表3)。

表3 防己茯苓湯乙醇－乙酸乙脂組分 (EAFD)對激活和靜息的巨噬細(xì)胞的影響( ± s，n=6)Tab.3 Effects of nitrite accumulation and cell proliferation of EAFD on stimulated and restingmacrophages( ± s，n=6)

表3 防己茯苓湯乙醇－乙酸乙脂組分 (EAFD)對激活和靜息的巨噬細(xì)胞的影響( ± s，n=6)Tab.3 Effects of nitrite accumulation and cell proliferation of EAFD on stimulated and restingmacrophages( ± s，n=6)

組 別 劑量/(μg·mL－1)激活細(xì)胞 靜息細(xì)胞亞硝酸鹽/(μmol·L－1) 抑制率/% 細(xì)胞活力/% 亞硝酸鹽/(μmol·L－1) 細(xì)胞活力/%對照組 － 4.28±0.01 － 100.00±0.10 4.28±0.01 100.00±0.10模型組 － 45.78±0.02 － 54.06±0.03 － －乙醇-乙酸乙脂組分處理組 60 14.50±0.01 75.37 77.84±0.05 4.72±0.01 112.28±0.07 40 22.75±0.02 55.49 77.44±0.05 4.46±0.01 110.76±0.05 20 39.99±0.03 13.96 55.39±0.04 4.54±0.01 137.25±0.11

3.4 防己茯苓湯乙醇－乙酸乙脂提取組分的總抗氧化能力測定 如表4所示，乙醇－乙酸乙脂提取組分呈劑量依賴性提升總抗氧化能力。

3.5 防己茯苓湯乙醇－乙酸乙脂提取組分對iNOS和COX-2蛋白表達(dá)的影響 如圖1所示，乙醇－乙酸乙脂提取組分呈劑量依賴性抑制iNOS蛋白表達(dá) (P＜0.01)，對 COX-2表達(dá)僅在最高劑量60μg/mL有顯著抑制效果 (P＜0.05)。

4 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為水腫等癥，乃肺脾腎三臟相干之病，蓋水為至陰，故其本在腎;水化于氣，故其標(biāo)在肺;水惟畏土，故其制在脾。防己茯苓湯主治因脾氣虛弱而不能運(yùn)化水濕所致之證，是治療脾虛水腫證的基礎(chǔ)方［10］。 《水氣病脈證并治第十四》中記載:“皮水為并，四肢腫，水氣在皮膚中，四肢聶聶動者，防己茯苓湯主之?！爆F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)防己茯苓湯在臨床炎癥性疾病中也頗有療效，并在多種炎癥動物實(shí)驗(yàn)上得以驗(yàn)證。而近年大量的數(shù)據(jù)證實(shí)炎癥不僅僅是宿主對外來各種刺激物 (細(xì)菌、病毒、紫外線等)的防御反應(yīng)，腫瘤相關(guān)性炎癥已作為腫瘤的第7特征［11-12］。在慢性炎癥中，炎癌共用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如NF-κB和JAK2/STAT3被持續(xù)激活，誘使炎癥介質(zhì)如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達(dá)提高，同時(shí)在細(xì)胞因子、趨化因子的共同參與下，協(xié)同推動病程向惡性演化［13-14］。

防己茯苓湯中單味藥除黃芪外均能抑制巨噬細(xì)胞炎癥模型中NO過量產(chǎn)生。方中防己、茯苓為君藥，取利水消腫、祛風(fēng)止痛之功，使皮水從外而解。這和防己、茯苓乙醇提取物體外具有較強(qiáng)抗炎活性 (IC50分別為30.18μg/mL和54.01μg/mL)有一定聯(lián)系，但在其抗炎劑量對巨噬細(xì)胞具有殺傷作用。黃芪為臣藥，能益氣固表和振奮衛(wèi)陽，其在細(xì)胞炎癥模型中并未顯示具抗炎活性而對巨噬細(xì)胞具有一定促增殖作用，提示黃芪可能重在調(diào)節(jié)免疫，減少君藥的毒副作用。桂枝通陽達(dá)表，協(xié)助茯苓和黃芪發(fā)揮著行散水濕和鼓舞衛(wèi)陽的作用，也顯示一定的抗炎活性 (IC50為71.72μg/mL)。甘草益氣和中，用為佐使，協(xié)黃芪以健脾，體外具抗炎活性 (IC50為41.92μg/mL)且在該劑量對巨噬細(xì)胞增殖無影響，可能兼具抗炎和減毒的作用。單味藥單獨(dú)提取的乙醇提取物對體外細(xì)胞炎癥模型的抗炎活性不及方劑整體提取后乙醇－乙酸乙酯提取組分，且抑制靜息態(tài)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力如單用防己乙醇提取物，提示精制后的活性組分，具有一定的增效減毒的作用。傳統(tǒng)水煎獲得的提取物在抗炎方面的活性不及乙醇提取物，可能中藥抗炎類活性成分以脂溶性小分子居多，水煎制劑可能通過體內(nèi)代謝才能發(fā)揮較強(qiáng)功效。前期一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示南劉寄奴、祖師麻、桑枝、芫花等中藥其抗炎活性集中在乙醇提后的乙酸乙酯組分，主要是黃酮類成分［6，8-9，15］。在本研究中，乙醇 － 乙酸乙脂提取組分抑制炎癥關(guān)鍵合成酶iNOS和COX-2蛋白表達(dá)，同時(shí)提高總抗氧化能力，可作為防己茯苓湯抗炎藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表4 防己茯苓湯乙醇-乙酸乙脂組分 (EAFD)的總抗氧化能力測定( ± s，n=3)Tab.4 Antioxidants activities of EAFD(mmol/L Trolox equivalent， ± s，n=3)

表4 防己茯苓湯乙醇-乙酸乙脂組分 (EAFD)的總抗氧化能力測定( ± s，n=3)Tab.4 Antioxidants activities of EAFD(mmol/L Trolox equivalent， ± s，n=3)

注:與對照組相比，＊＊P ＜0.01。

級 別 劑量/(μg·mL－1) 抗氧化當(dāng)量 (1mmoL/L Trolox當(dāng)量)對照組(PBS) － 0.09±0.00乙醇-乙酸乙脂組分處理組400 0.37 ±0.01＊＊200 0.18±0.01 100 0.13±0.00陽性對照組(Trolox) 1 mmol·L－11

圖1 防己茯苓湯乙醇-乙酸乙脂組分 (EAFD)對iNOS和COX-2蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of EAFD on protein exprssion of iNOS and COX-2

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