阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征大鼠海馬病理改變及caspase-3的表達(dá)☆

史艷紅徐平 宋凱英潘成玉

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)是指由于上氣道狹窄或阻塞所致的每晚7h睡眠中呼吸暫停反復(fù)發(fā)作在30次以上，或平均每小時(shí)睡眠中呼吸暫停和低通氣次數(shù)(睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù))≥5次，伴有白天嗜睡、疲倦、反應(yīng)遲鈍及認(rèn)知功能障礙的一組臨床綜合征。研究表明OSAS的認(rèn)知功能障礙主要表現(xiàn)在短期記憶、警覺(jué)性、集中力、注意力和執(zhí)行能力等方面[1]。受損的腦結(jié)構(gòu)區(qū)域有大腦皮質(zhì)、海馬和白質(zhì)等。尤其海馬CA1區(qū)對(duì)間斷缺氧敏感[2]，易出現(xiàn)功能紊亂、結(jié)構(gòu)受損[3,4]。但具體機(jī)制尚不明確。間歇低氧動(dòng)物模型對(duì)OSAS的病理機(jī)制研究已經(jīng)取得一些成果，但由于不能模擬人類OSAS自然發(fā)病狀態(tài)及間歇低氧標(biāo)準(zhǔn)不一，使研究結(jié)果與臨床之間存在爭(zhēng)議。該實(shí)驗(yàn)采取本課題組前期予大鼠咽腔多點(diǎn)注射透明質(zhì)酸鈉凝膠建立上氣道阻塞的OSAS模型[5]。觀察海馬CA1區(qū)病理改變，檢測(cè)海馬caspase-3的mRNA表達(dá)，探討OSAS誘導(dǎo)海馬損害可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～250g，共20只。由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)SCXK(渝)2007-0005]。抽簽法隨機(jī)分組：正常對(duì)照組7只，OSAS組13只(因?yàn)榍捌陬A(yù)實(shí)過(guò)程中大鼠的死亡率約占一半，故設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組時(shí)OSAS組大鼠只數(shù)約加倍)。

1.2 模型制作

1.2.1 OSAS模型制作適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隔夜禁食12h，2%戊巴比妥鈉溶液55mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。仰臥固定于操作臺(tái)上，臨床耳鼻喉科所用鼻鏡作為開(kāi)口器，暴露大鼠咽腔，分別于雙側(cè)舌腭弓、咽腭弓及舌根處等多點(diǎn)注射醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠，注射處可見(jiàn)有局部小隆起。注射時(shí)觀察大鼠呼吸情況，動(dòng)物有呼吸暫停出現(xiàn)時(shí)即停止注射。整個(gè)操作過(guò)程用止血鉗將大鼠舌頭牽拉到口腔外直至動(dòng)物清醒，以防止窒息死亡。但可能因局部阻塞明顯，模型制作中及制作后1h內(nèi)有5只大鼠窒息死亡。

1.2.2 制作OSAS模型前后監(jiān)測(cè) OSAS模型制作前及制作4周后，用改造過(guò)的插件式多參數(shù)神經(jīng)監(jiān)護(hù)儀對(duì)大鼠各進(jìn)行1次腦電波、口鼻氣流及外周血氧飽和度的監(jiān)測(cè)。大鼠隔夜禁食12h，2%戊巴比妥鈉溶液25mg/kg腹腔注射淺麻醉模擬睡眠狀態(tài)(弱刺激無(wú)反應(yīng)，強(qiáng)刺激有反應(yīng))。監(jiān)測(cè)過(guò)程中，大鼠若有煩躁，追加原注射量1/5的2%戊巴比妥鈉溶液。以無(wú)菌針灸針為電極，分別刺入大鼠雙側(cè)瞳孔上方各0.5cm處及左、右側(cè)乳突處顱骨骨膜(依次為FP1、FP2、A1、A2電極放置位置。其中FP1、FP2為記錄電極，A1、A2為參考電極)。觀察大鼠腦電波變化情況?？诒菤饬鳠崦魝鞲衅髦糜诖笫蟊强浊胺?，觀察呼吸波變化情況，判斷是否有氣流呼出。包裹式血氧探頭經(jīng)皮監(jiān)測(cè)大鼠尾部血氧飽和度。判定標(biāo)準(zhǔn)：清醒期為高頻率、低波幅腦電波；漸出現(xiàn)低頻率、高波幅腦電波為睡眠期；胸腹式呼吸運(yùn)動(dòng)存在而口鼻氣流呼吸波消失為阻塞性睡眠呼吸暫停；呼吸波消失≥2.5 s為一次呼吸暫停[6]。持續(xù)監(jiān)測(cè)2h，統(tǒng)計(jì)血氧飽和度和呼吸暫停次數(shù)。計(jì)算每只大鼠平均血氧飽和度、最低血氧飽和度及呼吸暫停指數(shù)，并且造模后與造模前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定為造模成功。

12周后隔夜空腹12h，2%戊巴比妥鈉溶液55mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，斷頭取腦，分離左側(cè)海馬，置入放有RNAiso Plus試劑的EP管中，存-80℃冰箱，備實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。取右側(cè)視交叉后1mm至4mm處的冠狀切面腦組織浸泡于10%甲醛溶液，備HE染色。

1.3 HE染色觀察海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)改變腦組織在10%甲醛溶液中固定24h后，制備組織石蠟塊，行冠狀切片，片厚5μm。常規(guī)HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CAI區(qū)結(jié)構(gòu)改變。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)海馬caspase-3表達(dá) 樣本總RNA提取，并反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。caspase-3上游引物：GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG，下游引物：GGCGCAAA-GTGACTGGATGA，內(nèi)參β-actin上游引物：GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA，下游引物：GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG(引物由寶生物工程大連有限公司合成)，總反應(yīng)體系為15μL，其中SYBR Premix Ex TaqTMⅡ7.5μL，上下游引物(10μmol/L)共0.5μL，cDNA(0.5μL/mL)模板3μL，加0.1%DEPC 4μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃，3 min，隨后是95℃，10 s；56℃，45 s共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)緩慢加熱到95℃1min，55℃1min，80個(gè)循環(huán)，55℃10s。每個(gè)樣本同時(shí)行目的基因和內(nèi)參基因檢測(cè)，均做復(fù)孔。根據(jù)Ct值計(jì)算各樣品caspase-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量：①dCt=(Ct1+Ct2)／2-中間值；②基因的表達(dá)=2-dCt；③相對(duì)定量=目的基因的表達(dá)／內(nèi)參基因的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，各組變量均經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，組內(nèi)造模前后資料對(duì)比分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；變量間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，動(dòng)作迅速。OSAS模型組大鼠出現(xiàn)睡眠打鼾，精神狀態(tài)較差，反應(yīng)靈敏性下降，行動(dòng)遲緩；不明原因夜間死亡1只。

2.2 造模前后大鼠各呼吸指標(biāo)比較 造模4周后再次行睡眠呼吸監(jiān)測(cè)，其中1只大鼠僅有血氧飽和度的輕度降低，無(wú)明顯的呼吸暫停，故剔除之，不參與下一步實(shí)驗(yàn)。OSAS模型組造模后與造模前比較，平均血氧飽和度、最低血氧飽和度均明顯降低(t=9.34，P＜0.01；t=16.64，P＜0.01)，呼吸暫停指數(shù)明顯升高(t=-11.00，P＜0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.3 大鼠海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果正常對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊致密，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。OSAS模型組大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，周圍間隙增大，神經(jīng)元細(xì)胞體積縮小，核固縮深染，核裂解等缺血缺氧性改變。見(jiàn)圖1。

2.4 大鼠海馬caspase-3 mRNA的表達(dá)每一個(gè)樣本同時(shí)擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，擴(kuò)增曲線呈“s”型，熔解度曲線呈單一峰，見(jiàn)圖2。OSAS模型組與正常對(duì)照組比較，大鼠海馬caspase-3 mRNA表達(dá)(1.21±0.35，0.67±0.10)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.93，P＜0.01)。

2.5 相關(guān)性分析OSAS模型組大鼠海馬caspase-3表達(dá)與平均血氧飽和度、最低血氧飽和度均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.88，P=0.02；r=-0.89，P=0.02)，與呼吸暫停指數(shù)無(wú)相關(guān)性(r=0.77，P=0.07)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)阻塞上氣道建立類似人類OSAS的大鼠模型，監(jiān)測(cè)到造模后較造模前平均血氧飽和度、最低血氧飽和度均明顯下降，呼吸暫停指數(shù)增加。出現(xiàn)OSAS的臨床癥狀，如睡眠打鼾，呼吸暫停；精神狀態(tài)較差，反應(yīng)靈敏性漸下降，行動(dòng)遲緩。動(dòng)物夜間死亡考慮可能與上氣道阻塞窒息有關(guān)。說(shuō)明該OSAS模型建立成功，該造模方法穩(wěn)定、可靠。

表1 造模前后大鼠平均血氧飽和度、最低血氧飽和度及呼吸暫停指數(shù)比較(n=6,x±s)

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)HE×200

圖2 基因的擴(kuò)增和溶解曲線

OSAS主要以反復(fù)間斷缺氧導(dǎo)致全身各器官組織受損為致病特點(diǎn)。神經(jīng)系統(tǒng)耗氧量大，對(duì)缺氧敏感，間斷低氧對(duì)海馬的損害可能是認(rèn)知功能障礙的重要原因。作為形態(tài)學(xué)證據(jù)，MRI研究證明OSAS患者存在包括海馬在內(nèi)的腦結(jié)構(gòu)區(qū)域大量灰質(zhì)缺失[7]。而間歇低氧的動(dòng)物模型也證明海馬非常容易受損，尤其CA1區(qū)[2]。因此，實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞缺血缺氧性損傷的表現(xiàn)，可能與大鼠睡眠中上氣道阻塞或低通氣導(dǎo)致慢性間歇低氧有關(guān)。而海馬神經(jīng)元的受損和缺失，可通過(guò)N-乙酰天門冬氨酸/肌酸水平下降等機(jī)制導(dǎo)致認(rèn)知障礙的發(fā)生[8]。由于考慮到動(dòng)物耐受性有限，未進(jìn)行水迷宮記憶能力測(cè)試，沒(méi)有認(rèn)知功能受損的具體證據(jù)，較為遺憾。

caspase-3是caspase家族中最為重要的一種半胱氨酸蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的總開(kāi)關(guān)?；罨腸aspase-3可切割許多蛋白質(zhì)底物，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白酶級(jí)聯(lián)切割放大，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。同時(shí)，caspase-3還可直接酶解抑凋亡基因Bcl-2，使其轉(zhuǎn)為觸發(fā)凋亡。因此，caspase-3的表達(dá)水平是影響細(xì)胞凋亡的重要因素。實(shí)驗(yàn)中OSAS模型組大鼠海馬caspase-3 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高，提示OSAS大鼠海馬區(qū)啟動(dòng)了凋亡程序，使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加。細(xì)胞凋亡是引起海馬神經(jīng)元數(shù)目減少的重要原因之一。因此，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞受損和缺失可能與caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)。OSAS導(dǎo)致capase-3表達(dá)增加的機(jī)制尚不明確，可能與體內(nèi)TNF-α的上調(diào)激活死亡受體，以及能量障礙、大量氧自由基等觸發(fā)線粒體凋亡通路等有關(guān)。與該實(shí)驗(yàn)相似的研究，有間歇低氧大鼠模型用TUNEL方法檢測(cè)到海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的報(bào)道[9]。

總之，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)OSAS大鼠模型，證實(shí)了反復(fù)上氣道阻塞或低通氣可誘導(dǎo)海馬Caspase-3表達(dá)增加，神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致CA1區(qū)神經(jīng)元缺損，從而影響海馬結(jié)構(gòu)功能?？赡茉谝欢ǔ潭壬辖沂玖薕ASA患者認(rèn)知損害機(jī)制。

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