丙戊酸抑制大鼠實驗性自身免疫性神經(jīng)炎機制研究

賁 瑩，張鳳華，梁文杰，張 冬，方 倩

實驗性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental autoimmune neuritis，EAN)是一種由T細胞介導(dǎo)的炎性脫髓鞘性周圍神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病，與格林－巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)的臨床表現(xiàn)和免疫學(xué)特點相似。GBS的病因治療主要為免疫球蛋白靜脈滴注和血漿置換，費用昂貴，且治療后仍有約25%的患者有肢體無力等后遺癥。丙戊酸是由8個碳原子和脂肪酸支鏈組成的簡單化合物，臨床用于抗驚厥和癲癇治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，丙戊酸能拮抗多種損傷因素誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡，還能減少腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)產(chǎn)生，抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)激活，發(fā)揮抗炎作用，對抗炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷［1］。本研究應(yīng)用丙戊酸鈉治療EAN大鼠，觀察治療效果，分析治療作用機制，為臨床治療GBS提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 Lewis雄性大鼠36只，鼠齡8～10周，體重170～200 g，清潔級，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。注射用丙戊酸鈉購自Sigma公司。周圍神經(jīng)髓鞘抗原(P257-81)多肽購自上海吉爾生化有限公司;ED1抗活化的巨噬細胞抗體、CD3抗T淋巴細胞抗體購自Serotec公司;IL-17抗體、Foxp3染色緩沖組合購自eBioscience公司?？俁NA提取試劑(Trizol)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物有限公司，引物參照Gene Bank序列，應(yīng)用Primer Express 5.0軟件合成，由大連寶生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 分組:將實驗大鼠隨機分為治療組、模型組和正常組各12只。

1.2.2 模型建立:模型組及治療組大鼠雙后肢足底注射 200 μl抗原乳劑［將 100 μl完全弗氏佐劑(CFA)和含 P257-81(100 μg)的 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)100 μl用針式勻漿器混勻成油包水乳劑］。免疫當(dāng)天記為第0天。治療組于免疫0～15 d每天固定時段于大鼠腹腔注射300 mg/kg丙戊酸鈉(用1 ml PBS溶解稀釋)，模型組、正常組在同時點注射等量的PBS。

1.2.3 觀察指標

1.2.3.1 發(fā)病情況評估:免疫后每天對大鼠進行神經(jīng)系統(tǒng)體征評分［2］:0分:無異常;1分:尾部張力降低;2分:尾癱，翻正反射部分缺失;3分:翻正反射缺失;4分:步態(tài)失調(diào)、姿態(tài)異常;5分:后肢輕癱;6分:中度癱瘓;7分:后肢嚴重癱瘓;8分:四肢癱瘓;9分:瀕死;10分:死亡。

1.2.3.2 坐骨神經(jīng)病理及免疫組化改變:于免疫第16天斷頭處死大鼠，取部分坐骨神經(jīng)根置于10%甲醛溶液中固定24 h，流水沖洗1 h，制成石蠟塊，切片行HE染色，光鏡下觀察病理改變。

用免疫組化法對T細胞、巨噬細胞浸潤的情況進行檢測。常規(guī)脫蠟、滅活內(nèi)源酶、微波修復(fù)抗原、滴加10%標準豬血清封片。加一抗:CD3抗T淋巴細胞(1∶50)，ED1抗活化的巨噬細胞(1∶100)，于4℃孵育過夜。加二抗室溫孵育，滴加S-A/HRP，37℃孵育20 min，PBS 沖洗，DAB 顯色，蘇木素輕度復(fù)染、封片、觀察。應(yīng)用Image-Pro Plus系統(tǒng)(×400)采集圖像，進行陽性細胞面積分析，結(jié)果用陽性細胞面積占坐骨神經(jīng)橫切面面積的百分比表示。

1.2.3.3 外周血中Th17、Foxp3+Treg細胞檢測:采集大鼠外周血100 μl，加入紅細胞裂解液，用含0.5%皂甙的緩沖洗液透化處理10 min。在室溫下用兔抗鼠IL-17抗體(1∶100)進行細胞孵育1 h。應(yīng)用緩沖洗劑清洗2次，于暗室內(nèi)用FITC-標記的羊抗兔Ig-F(ab)2片段(1∶100)進行孵育1 h，而后進行流式細胞檢測。

采集大鼠外周血100 μl，加紅細胞裂解液，振蕩混勻后靜置10 min，離心，去上清，加PBS洗2遍，取100 μl放入流式管。加入 CD4-FITC、CD25-APC，預(yù)冷的PBS洗滌細胞，重懸細胞后加入破膜工作液混勻，避光4℃孵育30 min，加入Permeabilization Buffer工作液離心洗滌細胞，棄上清液。加入稀釋血清，避光孵育15 min，加入熒光標記Fox3抗體，避光孵育40 min，加入Permeabilization Buffer洗滌細胞去上清。用Flow Cytometry Staining Buffer重懸細胞，上機檢測。

1.2.3.4 大鼠淋巴結(jié)中細胞因子的變化:用Trizol法從大鼠腹股溝淋巴結(jié)中提取RNA，－70℃保存。用逆轉(zhuǎn)錄聚合式酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測TNF-α、γ 干擾素(IFN-γ)、IL-17、β 型轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)的mRNA表達水平。引物序列:

取RT-PCR產(chǎn)物5 μl經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)成像，半定量分析用Quantityone軟件測定各電泳條帶光密度值，按公式:mRNA相對光密度值=目的條帶光密度值/甘油醛-3磷酸脫氫酶(GAPDH)的光密度值，將表達量化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，比較采用t檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況 治療組發(fā)病時間較模型組顯著延遲，疾病高峰期(免疫后第15天)神經(jīng)系統(tǒng)體征評分明顯低于EAN模型組(P＜0.05)，見表1。

表1 大鼠實驗性自身免疫性神經(jīng)炎模型組和治療組發(fā)病時間及神經(jīng)系統(tǒng)體征評分(±s)

表1 大鼠實驗性自身免疫性神經(jīng)炎模型組和治療組發(fā)病時間及神經(jīng)系統(tǒng)體征評分(±s)

注:治療組為于免疫0～15 d每天固定時段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸鈉(用1 ml PBS溶解稀釋)，模型組為免疫后同時點注射等量PBS;aP＜0.05

組別 只數(shù) 發(fā)病時間(d)神經(jīng)系統(tǒng)體征評分(分)治療組 12 12.02 ±1.64a 2.63 ±1.09a 12 9.11 ±1.16 6.58 ±1.70模型組

2.2 坐骨神經(jīng)的髓鞘脫失和炎性細胞浸潤情況治療組坐骨神經(jīng)血管周圍髓鞘脫失及炎性細胞浸潤情況較模型組顯著減輕(圖1)。模型組坐骨神經(jīng)有大量T細胞和巨噬細胞浸潤，其中以巨噬細胞為多，治療組細胞浸潤較模型組明顯減少(P＜0.05)(圖2、3，表 2)。

圖1 大鼠實驗性自身免疫性神經(jīng)炎模型組和治療組坐骨神經(jīng)切片病理結(jié)果(HE×400) A.模型組;B.治療組

圖2 大鼠實驗性自身免疫性神經(jīng)炎模型組和治療組坐骨神經(jīng)切片CD3免疫組化染色結(jié)果(HE×400)

圖3 大鼠實驗性自身免疫性神經(jīng)炎模型組和治療組坐骨神經(jīng)切片ED1免疫組化染色結(jié)果(HE×400)

表2 大鼠實驗性自身免疫性神經(jīng)炎模型組和治療組坐骨神經(jīng)切片T細胞、巨噬細胞陽性面積(±s，%)

表2 大鼠實驗性自身免疫性神經(jīng)炎模型組和治療組坐骨神經(jīng)切片T細胞、巨噬細胞陽性面積(±s，%)

注:治療組為于免疫0～15 d每天固定時段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸鈉(用1 ml PBS溶解稀釋)，模型組為免疫后同時點注射等量PBS;aP＜0.05

組別 只數(shù) T 細胞 巨噬細胞治療組 12 0.24 ±0.10a 1.67 ±1.16a 12 0.58 ±0.14 6.15 ±1.49模型組

2.3 外周血中Th17、Foxp3+Treg細胞檢測情況模型組與治療組外周血中Th17、Foxp3+Treg細胞所占百分比均顯著高于正常組(P＜0.05);治療組外周血中Th17細胞所占百分比顯著低于模型組，F(xiàn)oxp3+Treg細胞所占百分比顯著高于模型組(P＜0.05)，見表3。

表3 3組外周血中Th17和Foxp3+Treg細胞所占比例(±s，%)

表3 3組外周血中Th17和Foxp3+Treg細胞所占比例(±s，%)

注:治療組為于免疫0～15 d每天固定時段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸鈉(用1 ml PBS溶解稀釋)，模型組和正常組均同時點注射等量PBS;與正常組比較，aP＜0.05;與模型組比較，cP ＜0.05

組別 只數(shù) Th17細胞 Foxp3+Treg 細胞治療組 12 1.85 ±0.46ac 15.09 ±1.34ac 12 1.18 ±0.26 5.03 ±0.94模型組 12 3.67 ±0.38a 6.26 ±0.75a正常組

2.4 淋巴結(jié)中細胞因子表達情況 模型組與治療組淋巴結(jié)中 TNF-α、IFN-γ、IL-17 和 TGF-β 的 mRNA表達水平均較高于正常組(P＜0.05);治療組大鼠淋巴結(jié)中TNF-α、IFN-γ和IL-17的mRNA表達水平低于模型組，TGF-β的mRNA表達水平高于模型組(P ＜0.05)，見表4。

表4 3組淋巴結(jié)中細胞因子mRNA表達情況(±s，%)

表4 3組淋巴結(jié)中細胞因子mRNA表達情況(±s，%)

注:治療組為于免疫后0～15 d每天固定時段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸鈉(用1 ml PBS溶解稀釋)，模型組和正常組均同時點注射等量PBS;TNF-α為腫瘤壞死因子α，IFN-γ為γ干擾素，IL-17為白介素17，TGF-β為β型轉(zhuǎn)化生長因子;與正常組比較，aP ＜0.05;與模型組比較，cP ＜0.05

組別 只數(shù) TNF-α IFN-γ IL-17 TGF-β治療組 12 0.38 ±0.02ac0.45 ±0.08ac0.63 ±0.17ac0.74 ±0.15ac 12 0.17 ±0.05 0.23 ±0.04 0.36 ±0.09 0.28 ±0.13模型組 12 0.63 ±0.04a 0.75 ±0.03a 1.29 ±0.11a 0.62 ±0.16a正常組

3 討論

GBS是由于非特異性感染所引起的自身免疫性多發(fā)性周圍神經(jīng)病。在病理方面，活化的輔助性T細胞可識別抗原呈遞細胞上的周圍神經(jīng)自身抗原，對EAN的啟動起著重要作用［3］?；罨木奘杉毎ㄟ^直接的吞噬攻擊和分泌炎性介質(zhì)引發(fā)髓鞘脫失，清除巨噬細胞并抑制其活性可抑制EAN的發(fā)展［4］。本研究結(jié)果顯示，丙戊酸減少了周圍神經(jīng)系統(tǒng)中T細胞、巨噬細胞的浸潤，因此，該藥能夠使局部炎癥減輕，髓鞘脫失減少，使EAN病情得到改善。

細胞因子對炎癥和免疫有重要的調(diào)節(jié)作用。IFN-γ、TNF-α能夠激活巨噬細胞，增加血－神經(jīng)屏障的通透性。其中，IFN-γ能誘導(dǎo)血旺細胞、巨噬細胞主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類抗原(MHC-Ⅱ)表達，TNF-α能上調(diào)iNOS特異性mRNA在施萬細胞表達，促進釋放 NO。IL-17能誘導(dǎo) TNF、IL-6、黏附分子1(ICAM-1)、NO和前列腺素E2的產(chǎn)生，促進T細胞激活，引起組織損傷［5-6］。TNF-α、IFN-γ、IL-17這些促炎細胞因子在EAN中起著啟動和促進作用［7］。TGF-β具有抑制抗原呈遞細胞及拮抗效應(yīng)性T細胞的功能，并可誘導(dǎo)初始CD4+T細胞轉(zhuǎn)化為Foxp3+Treg 細胞，從而抑制免疫應(yīng)答［8］。TGF-β 在EAN中起著控制炎性反應(yīng)、促進組織修復(fù)的作用［9］。免疫應(yīng)答時細胞因子譜系的產(chǎn)生決定著免疫應(yīng)答的結(jié)局。本研究結(jié)果顯示，丙戊酸能減少TNF-α、IFN-γ、IL-17 mRNA 的表達，增加 TGF-β mRNA的表達，從而使EAN的自身免疫應(yīng)答減輕。

Th17和Foxp3+Treg細胞同屬于CD4+T細胞。Th17 細胞通過分泌 IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α、集落刺激因子等促炎細胞因子參與自身免疫，在誘導(dǎo)自身免疫的組織損害及炎癥過程中起著決定性的作用。Th17細胞能促進多種自身免疫性疾病發(fā)生，如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、哮喘等［5］。Foxp3+Treg細胞能夠直接抑制T細胞，并可分泌TGF-β抑制免疫系統(tǒng)的激活，并因此預(yù)防了過度的炎性反應(yīng)和(或)自身免疫，從而致免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)［10］。Foxp3+Treg細胞能夠減弱自身免疫疾病實驗動物模型中(包括自身免疫性腦脊髓炎、糖尿病、胃炎、狼瘡、前列腺炎和甲狀腺炎等)的免疫應(yīng)答［11］。Th17和Foxp3+Treg細胞兩者相互拮抗，從而維持機體免疫狀態(tài)相對穩(wěn)定。本研究結(jié)果顯示，丙戊酸可使 EAN大鼠外周血中Th17細胞減少，F(xiàn)oxp3+Treg細胞增加，以減輕病情。

丙戊酸是臨床治療雙重精神障礙和癲癇的常用藥物。近年來發(fā)現(xiàn)其作為組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)可抑制 HDAC活性，通過改變組蛋白乙?；竭_到染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑，從根本上調(diào)節(jié)基因表達［12］。目前的研究表明，HDACi在多種動物模型中具有抗炎作用，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等［13］。HDACi能增加激活的Foxp3+Treg細胞的數(shù)量［14］，調(diào)節(jié) T細胞分化，有效地減少促炎細胞因子如 IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-6、IL-17 和 IL-17F 的表達［13］。因此，丙戊酸可能通過對HDAC的抑制效應(yīng)減輕EAN的癥狀。

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