納豆激酶生產(chǎn)菌BSNK-5鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

李淑英 聶瑩 杜歡 趙仲麟 袁超 李燕 宋曉燕 唐選明

納豆激酶（Subtilisin NAT）是由枯草芽孢桿菌分泌表達的高效纖維蛋白溶解酶，最早從傳統(tǒng)的日本大豆發(fā)酵產(chǎn)品納豆中發(fā)現(xiàn)［1］。納豆激酶對纖維蛋白顯示了極高的底物特異性［2］，其血栓溶解活性是纖溶酶的4倍［3，4］。納豆激酶可以直接溶解交聯(lián)狀的血栓塊，還可以催化血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶，增加體內(nèi)血栓溶解因子的合成，失活纖維蛋白溶解抑制劑等［4-7］。納豆激酶除了溶解血栓外，還可以降血壓、血脂和膽固醇［8］，誘導(dǎo)晚期玻璃體分解，治療玻璃體視網(wǎng)膜紊亂病人等［6］。與臨床應(yīng)用的溶栓藥物相比，納豆激酶具有溶纖活性高、安全可靠、無毒副作用、半衰期長、在胃腸道中穩(wěn)定性好等優(yōu)點。該蛋白除了靜脈注射外，還可以口服，生產(chǎn)成本低廉［6，9］，具有重要的開發(fā)價值。

優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝，可以明顯提高芽孢桿菌的納豆激酶產(chǎn)量［9-11］。本試驗對分離篩選的納豆激酶生產(chǎn)菌BSNK-5進行了菌落形態(tài)觀察和分子鑒定；并采用單因素和正交試驗對篩選菌株產(chǎn)納豆激酶的液體發(fā)酵條件進行了初步研究，以期提高納豆激酶產(chǎn)量，為該酶的進一步擴大培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus natto）BSNK-5，由本實驗室分離并保存。

1.1.2 主要試劑 纖維蛋白原（牛血，批號：140626-201009）、尿激酶標準品（1280U/支）和凝血酶（560U/支）均購于中國藥品生物制品檢定所，LB Broth Ultrapure（USB），酵母浸粉（南通香地生物有限公司），胰蛋白胨（OXOID），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面和種子培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：氮源，碳源，Na2HPO40.6％，NaH2PO40.1％，MgSO40.05％，CaCl20.02％，pH7.0。1.1.4 儀器 立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-50A，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-200H，上海智城分析儀器制造有限公司）、臺式高速離心機（TG16MW，湖南赫西儀器裝備有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株

BSNK-5，用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察拍照。

分子生物學(xué)鑒定：提取BSNK-5的基因組，細菌16S rDNA擴增引物及方法參照文獻［12］，擴增片段送Invitrogen公司測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站利用Blast進行比對，調(diào)出相似序列，用Clustal X1.83和 MEGA 3.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［13］。

1.2.2 菌種的培養(yǎng) 用接種環(huán)挑取斜面菌種，接于種子培養(yǎng)基（裝液量10mL/50mL）中，37℃，200r/min搖床培養(yǎng)24h。然后根據(jù)試驗設(shè)計，以不同的接種量接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基（裝液量20mL/100mL）中，設(shè)置不同溫度，200r/min搖床培養(yǎng)不同時間。

1.2.3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.2.3.1 最適氮源優(yōu)化 固定碳源為2％的葡萄糖，分別采用濃度為1％的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨和酵母浸粉為氮源，其他試劑同1.1.3配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基。以3％的接種量接菌種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200r/m搖床培養(yǎng)72h。離心收集上清液測納豆激酶活力，以確定最佳氮源。每個試驗重復(fù)3次。

1.2.3.2 最適碳源優(yōu)化 據(jù)1.2.3.1確定最佳氮源為酵母浸粉，故采用氮源為1％的酵母浸粉，碳源分別采用濃度為2％的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和木糖，其他試劑同1.1.3配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基。以3％的接種量接菌種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200r/min搖床培養(yǎng)72h。離心收集上清液測納豆激酶活力，以確定最佳碳源。每個試驗設(shè)3個重復(fù)。

1.2.4 酶活測定方法（纖維蛋白平板法）瓊脂糖-纖維蛋白平板的配制：含有1％瓊脂糖的pH7.2 PBS溶液，50℃恒溫水浴45min，加入凝血酶（最終活性0.05U/mL）和同樣溫度下水浴10min的等量含有0.1％纖維蛋白原的pH7.2 PBS溶液，混勻。9cm×9cm的培養(yǎng)皿加入35mL此溶液，凝固后用直徑5mm打孔器打孔，上樣10μL（菌株發(fā)酵液的上清液），37℃恒溫培養(yǎng)18h，測量溶解圈的直徑，計算溶解圈的面積，根據(jù)尿激酶標準曲線計算酶的活力單位。

尿激酶標準曲線的制作參考馬明等［14］的方法。

2 結(jié)果

2.1 BSNK-5菌種鑒定

2.1.1 形態(tài)特征 LB平板劃線，37℃培養(yǎng)24h后，菌落圓形，乳白色，不透明，邊緣不整齊，表面干燥，有皺褶，用接種環(huán)挑菌落有拉絲現(xiàn)象，菌落與培養(yǎng)基不結(jié)合，菌落正反面顏色相同。顯微鏡下個體形態(tài)觀察，菌株桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色呈陽性，產(chǎn)芽孢，芽孢橢圓形，中生或近中生（圖1）。

圖1 BSNK-5顯微鏡形態(tài)觀察

2.1.2 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建 PCR擴增所得BSNK-5菌株16S rDNA全長1509bp，將BSNK-5的16S rDNA測序結(jié)果經(jīng)Blast 比對，與BSNK-5菌株16S rDNA同源性較高的菌株均為枯草芽孢桿菌菌株，從中選擇15條同源性高于99％的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖2）顯示，BSNK-5菌株與Bacillus subtillis 屬菌株在同一分枝上，結(jié)合菌株形態(tài)特征，初步鑒定BSNK-5為枯草芽孢桿菌屬菌株。

圖2 BSNK-5的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 尿激酶的標準曲線

測量不同濃度尿激酶在纖維蛋白平板上2個互相垂直的溶解圈直徑，并計算溶解圈的面積，重復(fù)試驗3次，求平均值，制作尿激酶標準曲線，得出了尿激酶的活力與溶解圈面積呈線性關(guān)系，結(jié)果見圖3。

圖3 尿激酶標準曲線

由圖3可知，尿激酶標準曲線線性關(guān)系為y=1.9769x-106.33，R2=0.9824。此標準曲線可用于測定納豆激酶的活性，根據(jù)納豆激酶溶解圈面積大小，可計算出納豆激酶的纖溶活性，即相當(dāng)于尿激酶的活力單位。

2.3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.3.1 最適氮源的優(yōu)化 固定碳源為2％的葡萄糖，分別采用濃度為1％的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨和酵母浸粉為氮源，其他試劑同1.1.3配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基。以3％的接種量接菌種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200r/min搖床培養(yǎng)72h。離心收集上清液測納豆激酶活力，以確定最佳氮源。每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果見圖4。

圖4 不同氮源對菌株產(chǎn)納豆激酶的影響

由圖4可知，不同氮源對納豆激酶的產(chǎn)生有很大的影響，4種氮源的產(chǎn)酶量差距很大，以酵母浸粉為最高，達到1115U/mL，大豆蛋白胨其次，胰蛋白胨最低。酵母浸粉是微生物源的培養(yǎng)基成分，相比于動植物源蛋白胨和大豆蛋白胨，可能更易于微生物的吸收利用。故選取酵母浸粉為最佳氮源。

2.3.2 最適碳源的優(yōu)化 由圖5可知，4種碳源均適宜菌種的發(fā)酵，產(chǎn)酶量都較高，單糖葡萄糖和木糖的產(chǎn)酶量相當(dāng)，二糖蔗糖和麥芽糖的產(chǎn)酶量相當(dāng)；但以二糖為碳源時BSNK-5的產(chǎn)酶量較單糖的產(chǎn)酶量高，而兩種二糖中以麥芽糖為碳源時菌種產(chǎn)酶量最高，達到986U/mL，與李文亮等［15］的研究一致，且麥芽糖的價格比較適宜，來源比較廣泛，適宜工業(yè)化生產(chǎn)，故碳源采用麥芽糖為最佳。

2.3.3 培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶量的影響 本研究在確定了最佳氮源和碳源的試驗基礎(chǔ)上設(shè)計6因素5水平的完全隨機正交試驗，考察不同濃度的氮源和碳源，不同起始pH的發(fā)酵培養(yǎng)液，不同接種量、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時間對BSNK-5發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響。正交試驗設(shè)計見表1，試驗結(jié)果見表2。

圖5 不同碳源對菌株產(chǎn)納豆激酶的影響

表1 正交試驗設(shè)計簡表

由表2可知酵母浸粉和麥芽糖的百分含量，發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH值，菌種接種量，培養(yǎng)溫度，發(fā)酵時間對BSNK-5液體發(fā)酵產(chǎn)納豆激的量有明顯影響。25個平行試驗中有2個試驗結(jié)果是相同的，酶活最高達到1160U/mL，這兩個最佳的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件分別為：（1）2％的酵母浸粉、3％的麥芽糖、最適pH為6.5、接種量為5％、培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)時間為60h；（2）2.5％的酵母浸粉、2％的麥芽糖、最適pH為7.5、接種量為3％、培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)時間為72h。

3 討論

納豆激酶突出的生物學(xué)功能，特別是在血栓溶解方面的優(yōu)勢使其成為了當(dāng)今研究的熱點。目前關(guān)于納豆激酶的研究主要是提高該酶的產(chǎn)量，主要途徑集中于以下幾個方面。

首先，篩選納豆激酶高產(chǎn)菌株。自從1987年Sumi等［1］第一次在納豆食品中發(fā)現(xiàn)了納豆激酶以來，人們相繼在一些海洋生物［14］，如skipjack shiokara［17，18］，日本納豆［5］，韓國的hungkook-jang soy sauce［19，20］，Doen-jang［21］，臺灣土壤［22］，中國的豆豉［2，23］和亞洲發(fā)酵蝦醬［24］中分離到了納豆激酶生產(chǎn)菌。為了得到更多優(yōu)勢菌株，人們?nèi)栽诓煌漠a(chǎn)品和環(huán)境中篩選納豆激酶生產(chǎn)菌株。

表2 正交試驗結(jié)果

其次，通過物理或化學(xué)方法誘變選育納豆激酶高產(chǎn)菌株。夏麗等［25］通過紫外線直接照射涂菌蛋白平板，篩選到一個高產(chǎn)突變株，其纖溶活性比出發(fā)菌株提高了8.81％。關(guān)志偉等［26］通過鹽酸羥胺和紫外線復(fù)合誘變獲得一株高產(chǎn)納豆激酶突變株，其產(chǎn)酶活性比野生菌提高了68％。劉新梅等［27］通過對納豆菌原生質(zhì)體紫外誘變得到一株高產(chǎn)納豆激酶菌株，其發(fā)酵液的酶活力比誘變前提高了74.5％。

再者，對納豆激酶生產(chǎn)菌發(fā)酵條件優(yōu)化提高納豆激酶的產(chǎn)量。優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝，可以明顯提高芽孢桿菌的納豆激酶產(chǎn)量［9-11］。研究發(fā)現(xiàn)，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源、碳源及其百分含量，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，菌種接種量，培養(yǎng)溫度，發(fā)酵時間等各個因素都會明顯影響納豆芽孢桿菌的生長狀態(tài)，從而影響到酶的產(chǎn)量。芽孢桿菌在營養(yǎng)缺乏或不適的環(huán)境極易形成芽孢，進入休眠狀態(tài)，從而停止產(chǎn)酶，這也是芽孢桿菌在實際生產(chǎn)應(yīng)用中的一個瓶頸。

本研究對實驗室分離的納豆激酶高產(chǎn)菌株BSNK-5進行鑒定，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確認為枯草芽孢桿菌屬菌株。對BSNK-5發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的各個因素進行了初步的探討研究，通過優(yōu)化該菌株發(fā)酵過程中的發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源、碳源及其百分含量，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，菌種接種量，培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時間，盡量使菌株處于最適生長環(huán)境，提高納豆激酶的產(chǎn)量。試驗結(jié)果也進一步證實在優(yōu)化條件下，BSNK-5的納豆激酶產(chǎn)量明顯提高，高達1160U/mL。與之前相比（發(fā)酵條件優(yōu)化前BSNK-5的納豆激酶酶活力為303U/mL），活性提高到283％。

4 結(jié)論

通過形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定，BSNK-5為枯草芽孢桿菌屬菌株。對影響B(tài)SNK-5液體發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的不同因素進行了初步探討研究。由液體發(fā)酵產(chǎn)酶的單因素和正交試驗結(jié)果表明納豆激酶的最佳產(chǎn)酶條件為：（1）2％酵母浸粉，3％麥芽糖，0.6％Na2HPO4，0.1％ NaH2PO4，0.05％ MgSO4，0.02％CaCl2，pH6.5，接種量為5％，30℃發(fā)酵培養(yǎng)60h；（2）2.5％酵母浸粉，2％麥芽糖，0.6％Na2HPO4，0.1％NaH2PO4，0.05％ MgSO4，0.02％ CaCl2，pH7.5，接種量為3％，30℃發(fā)酵培養(yǎng)72h。在最適產(chǎn)酶條件下納豆激酶的活性為1160U/mL，是之前的283％。

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