蘋果銹果類病毒屬屬級寡核苷酸芯片篩查方法的建立

張永江 辛言言 朱水芳 李世訪

蘋果銹果類病毒屬（Apscaviroid）屬于馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒科（Pospiviroidae），根據(jù)國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第九次分類報告，該屬包括蘋果銹果類病毒（Apple scar skin viroid，ASSVd）、蘋果凹類病毒（Apple dimple fruit viroid，ADFVd）、柑橘曲葉類病毒（Citrus bent leaf viroid，CBLVd）、澳洲葡萄類病毒（Australian grapevine viroid，AGVd）、柑橘矮化類病毒（Citrus dwarfing viroid，CDVd；又名柑橘類病毒 III，Citrus viroid III，CiVd III）、柑橘類病毒V（Citrus viroid V，CVd-V）、柑橘類病毒VI（Citrus viroid VI，CVd-VI）、葡萄黃點類病毒 1（Grapevine yellow speckle viroid 1，GYSVd-1）、葡萄黃點類病毒2（Grapevine yellow speckle viroid 2，GYSVd-2）及梨皰狀潰瘍類病毒（Pear blister canker viroid，PBCVd）等10種類病毒［1］。該屬的類病毒可侵染蘋果、梨、桃子、柑橘及葡萄等多種重要的果樹。蘋果銹果類病毒侵染蘋果可引起銹果病導致果實變扁、花臉、畸形和裂果，是蘋果生產(chǎn)中毀滅性的病害之一［2，3］；葡萄黃點類病毒則導致葡萄病株葉片黃色斑點或形狀不規(guī)則的黃色班塊，造成葡萄大量減產(chǎn)［4］；柑橘類病毒導致樹勢減弱，產(chǎn)量降低［5］；梨皰狀潰瘍類病毒危害梨樹，導致其產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴重時可引起果樹急劇衰退，提早枯死而絕收，給果樹生產(chǎn)帶來很大的影響［6］。該屬類病毒可通過種子、嫁接、生產(chǎn)工具及介體等多種途徑傳播，而且其寄主在我國廣泛種植，因此一旦建立初侵染源，很容易在果園中擴散傳播，病情逐年加重并成為全株永久性病害，必須清除病株才能控制病害的蔓延；該病毒會使果實商品價值大大降低，不但嚴重影響果農(nóng)收入，同時也制約了我國水果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。為有效防止該屬類病毒的傳播擴散，除了加強種苗監(jiān)管及田間管理措施外，有效的檢測篩查技術(shù)也是必要的手段。

目前已有指示植物法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、核酸斑點雜交法及RT-PCR等多種技術(shù)用于該屬類病毒的檢測。在國內(nèi)，馬先鋒等［5］采用指示植物法及RT-PCR技術(shù)對湖南省柑橘類樣品中的柑橘類病毒III進行了檢測；趙英等［7］采用斑點雜交法成功檢測到新疆庫爾勒香梨上的蘋果銹果類病毒，還采用常規(guī)RT-PCR、原位RT-PCR及斑點雜交技術(shù)在國內(nèi)首次成功的從蘋果樹中檢測到了蘋果凹類病毒［8］；吳玉鵬等［9］首次采用RT-PCR技術(shù)對新疆庫爾勒地區(qū)香梨泡狀潰瘍類病毒進行了檢測，結(jié)果表明該技術(shù)可用于果樹無毒苗的生產(chǎn)及種質(zhì)資源的交流。國際上，Sipahioglu等［10］建立了蘋果銹果類病毒的常規(guī)RT-PCR檢測技術(shù)并應(yīng)用于土耳其部分商業(yè)果園中該病毒的分布調(diào)查，在263份蘋果樣品中檢測到121份呈陽性 ；Rizza等［11］采用 SYBR Green I 實時RT-PCR技術(shù)成功檢測了意大利枳苗中的柑桔類病毒III；Hassen等［6］首次采用RT-PCR技術(shù)從突尼斯果樹中檢測到梨皰狀潰瘍類病毒。另外還有RTPCR-ELISA用于蘋果銹果類病毒、蘋果凹類病毒及梨皰狀潰瘍類病毒的檢測［12］；多重PCR技術(shù)用于柑桔曲葉類病毒及柑橘矮化類病毒［13，14］，澳洲葡萄類病毒、葡萄黃點類病毒1及葡萄黃點類病毒2［15］，蘋果銹果類病毒、蘋果凹類病毒及梨皰狀潰瘍類病毒［16，17］的檢測。上述檢測方法在蘋果銹果類病毒屬類病毒的檢測中起到了重要的作用，然而這些方法通量低，一次只能檢測樣品中的一種或幾種類病毒；而且屬于特異性檢測，無法對變異大且變異位點多的類病毒進行檢測；特別是對于該屬內(nèi)可能出現(xiàn)的新種，缺乏有效的篩查能力，所以在檢疫中容易造成類病毒漏檢進而造成傳播擴散，導致巨大的經(jīng)濟損失和不良的社會影響。

為了彌補上述技術(shù)的缺陷，國內(nèi)外研究人員開展了廣譜性高通量篩查技術(shù)的研究，結(jié)果表明，從病原物較高的分類水平上進行篩查，可以有效提高新發(fā)病原微生物的篩查效果；同時可以結(jié)合芯片的高通量特點，從而大大提高篩查的效率。如Zhang等［18］在2010年建立的植物病毒屬級寡核苷酸芯片可以有效篩查到植物樣品中未知的新病毒。報道的結(jié)果表明了這種屬級水平芯片技術(shù)的實用性，但目前還沒有關(guān)于蘋果銹果類病毒屬篩查芯片的報道，本研究希望通過開展該項研究來建立該類病毒屬屬級水平上的篩查芯片體系。

1 材料與方法

1.1 材料

蘋果銹果類病毒及柑橘矮化類病毒陽性材料分別來自中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所分子植物病理研究室及湖南農(nóng)業(yè)大學國家柑橘改良中心長沙分中心。

核酸提取試劑Trizol及9N隨機引物為Invitrogen產(chǎn)品；ExTaq DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNasin為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；CbcScript酶為AMBION 公司產(chǎn)品；RNA及DNA純化試劑盒購自MN公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR體系 用于擴增柑橘矮化類病毒的引物及擴增程序參照馬先鋒等［5］的方法；用于擴增蘋果銹果類病毒的引物及擴增程序參照蘇前富等［19］的方法。

總RNA提?。菏褂肨rizol試劑，按說明書進行。

反轉(zhuǎn)錄 ：體系 20μL，DEPC-H2O 10μL、dNTP 1μL、下游引物 2μL、RNA 模板 1μL ；70℃反應(yīng) 5min，冰上放置5min；加入M-MLV酶5×buffer 4μL、M-MLV 酶 1μL、RNA 酶抑制劑 1μL，42℃反應(yīng)1h。

PCR擴增：在0.2mL的反應(yīng)管中加入cDNA產(chǎn)物 2μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、dNTP0.5μL、Taq 酶0.5μL、PCR 緩 沖 液 2μL 及 DEPCH2O 14μL，然后按照PCR反應(yīng)程序進行擴增，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 芯片體系

1.2.2.1 探針設(shè)計 從美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）及國際病毒學分類委員會（ICTV）數(shù)據(jù)庫下載核酸序列；去除90％以上長度與其他序列有95％相似度的核酸序列；以5個堿基作為間隔，連續(xù)提取所有40mer的核酸序列；以40％≤G+C含量≤60％、單個堿基含量≤50％、連續(xù)重復(fù)堿基數(shù)目≤4，且無＞6個堿基的發(fā)卡結(jié)構(gòu)為標準對核酸序列進行篩選，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比較以保證所獲得探針的特異性。

1.2.2.2 樣品標記 在0.2mL PCR管中加入PCR產(chǎn) 物 5μL、9N 隨 機 引 物 2μL、DEPC-H2O 12μL，95℃變性3min，冰浴5min。然后向反應(yīng)管中加入10×Klenow 酶緩沖液 2.5μL、dNTP 2μL、cy3-dCTP0.5μL、Klenow 酶 1μL。37℃反應(yīng) 1.5h，70℃變性5min，冰浴5min。

1.2.2.3 芯片雜交 包括2.4μL SSC（終濃度3×）、0.32μL SDS（終濃度0.2％）、4μL甲酰胺（終濃度25％）、1.6μL Denhardt’s（終濃度 5×）和標記樣品7.68μL。95℃變性 3min，冰浴 5min，瞬時離心。將雜交液加到芯片上，蓋好蓋玻片，42℃水浴雜交過夜。

1.2.2.4 芯片洗滌 雜交結(jié)束后，將芯片轉(zhuǎn)移到盛有 42℃洗液 I（2×SSC，0.2％ SDS）和 II（0.2×SSC）的清洗盒中清洗；然后2000r/min離心1min，除去芯片表面的液體。

1.2.2.5 芯片分析 在掃描儀中用532nm通道掃描分析，探針的信號值為探針前景值的中位值減去背景值的中位值。信噪比（Signal to Noise Ratio，SNR）為圖像對應(yīng)點內(nèi)所有信號值的中位值與背景值中位值的比值。樣品中若至少一條探針的信號值≥600且信噪比≥3，判為陽性（為蘋果銹果類病毒屬類病毒侵染）；探針的信號值＜600且信噪比＜2，判為陰性（不為蘋果銹果類病毒屬類病毒侵染）；其余情況判為可疑，需重復(fù)驗證。

1.2.3 芯片探針有效性驗證 為了驗證所設(shè)計探針的有效性，即探針是否能夠與熒光標記產(chǎn)物雜交。如能雜交，其雜交的信號值是否能夠滿足分析的要求，分別取蘋果銹果類病毒及柑橘矮化類病毒的RNA作為模板，按照1.2.1的方法進行擴增，將擴增產(chǎn)物按照1.2.2的方法進行標記、雜交及檢測，最后通過所獲得的數(shù)據(jù)來分析探針的有效性。

1.2.4 芯片與RT-PCR靈敏度比較試驗 將蘋果銹果類病毒的總RNA進行10倍梯度稀釋后用作模板，分別按照1.2.1和1.2.2的方法進行芯片與RT-PCR檢測，通過兩種方法能夠檢測到的總RNA最低稀釋倍數(shù)來比較兩者的靈敏度。

2 結(jié)果

2.1 芯片制備

采用生物信息學方法分析蘋果銹果類病毒屬類病毒的核苷酸序列，根據(jù)設(shè)定的探針設(shè)計原則，設(shè)計了35條40mer的屬級特異性寡核苷酸探針（具體探針序列已申請國家專利，專利申請?zhí)枮椋?01210193394.8），探針5'端用氨基修飾。將寡核苷酸探針通過芯片點樣儀點制到醛基基片上，矩陣為10×12（圖1），包括4個部分：Hex為芯片固定陽性質(zhì)控，PC為雜交陽性質(zhì)控，NC為雜交陰性質(zhì)控，其他位點為檢測探針；芯片使用的固相載體為醛基玻片。

圖1 芯片矩陣示意圖

2.2 芯片探針有效性驗證

應(yīng)用蘋果銹果類病毒及柑橘矮化類病毒的樣品對芯片探針進行驗證，芯片雜交結(jié)果如圖2及圖3所示。圖2中1、4、5、6、9及圖3中2、3的信號值均＞600，信噪比均＞3（表1），達到進行結(jié)果判定的標準，說明本研究建立的芯片雜交體系能夠在樣品檢測中獲得有效的探針信號點，從而對樣品中是否含有該屬類病毒進行判斷。

2.3 芯片靈敏度檢測結(jié)果

蘋果銹果類病毒總RNA按10、102及103梯度稀釋后進行cDNA合成、Klenow酶標記和雜交，反應(yīng)結(jié)束后對芯片進行洗滌掃描。結(jié)果如圖4所示，隨著稀釋梯度的增大，探針信號強度越來越小，103稀釋梯度已不具有可見信號點，因此該芯片的靈敏度閾值大約是102。具體陽性探針信號值及信噪比如表2所示。

圖2 蘋果銹果類病毒樣品驗證結(jié)果

圖3 柑橘類病毒III樣品驗證結(jié)果

表1 芯片探針有效性驗證結(jié)果

圖4 芯片靈敏度結(jié)果

表2 芯片靈敏度結(jié)果

2.4 RT-PCR靈敏度檢測結(jié)果

蘋果銹果類病毒總RNA按10、102及103梯度稀釋后進行RT-PCR檢測，電泳結(jié)果（圖5）表明可從陽性材料中擴增出約330bp的特異性目標條帶。隨著檢測總RNA稀釋倍數(shù)的增大，可以觀察到明顯的濃度梯度譜帶，稀釋梯度限點為102。

圖5 RT-PCR靈敏度檢測結(jié)果

3 討論

屬級篩查芯片技術(shù)是近年出現(xiàn)的一種用于某類病原物篩查的技術(shù)，該技術(shù)將芯片的高通量特性與屬級探針的兼容性特點相結(jié)合，大大提高了病原微生物篩查鑒定的能力，已在多種病原生物的篩查中得到應(yīng)用。Chou等［20］對屬級探針芯片進行了有益的嘗試，通過試驗確證了屬級芯片在新發(fā)病毒鑒定中的作用；Palacios 等［21］建立了一種名為GreeneChipPm的傳染病診斷芯片平臺，包括了病毒、細菌、真菌和寄生蟲的29455條探針，使用該平臺診斷出不明死因病人的病原生物為細菌。Huyghe等［22］對細菌序列進行探針篩選，獲得9 500余條探針，在此基礎(chǔ)上建立的芯片可區(qū)分混合細菌樣品里的未知細菌。Zhang等［18］建立了13屬植物病毒的屬級篩查芯片，發(fā)現(xiàn)了三七樣品中的一種新病毒；這些報道的結(jié)果證實了這種芯片技術(shù)的實用性。本研究以植物類病毒為研究對象，初步建立了蘋果銹果類病毒屬的屬級芯片篩查技術(shù)。與以往的生物學測定、正反向聚丙烯酰胺凝膠電泳、Northern雜交及RT-PCR等技術(shù)相比，該技術(shù)有以下優(yōu)點：芯片的探針是屬水平上的而非目前報道中針對特定類病毒種的特異性檢測探針，具有屬的特征，所以能夠兼容屬內(nèi)的所有類病毒；該技術(shù)通量高，一次反應(yīng)能夠確定某一樣品中是否含有該屬的類病毒（包括已知及未知的類病毒）。標準樣品驗證結(jié)果顯示，建立的芯片技術(shù)可得到有效的探針信號，表明了所設(shè)計探針的有效性。

如何獲得足夠的標記產(chǎn)物以便得到有效的雜交信號是芯片檢測過程中的一個重要環(huán)節(jié)。產(chǎn)物標記主要包括3種方式：樣品中病原物含量足夠多時，可在隨機引物進行的反轉(zhuǎn)錄過程中加入熒光標記的dNTP，從而獲得標記cDNA后直接進行雜交；含量中等的病原物可采用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄，在隨后的特異性引物PCR擴增中加入熒光標記的dNTP；含量較低的病原物需要在反轉(zhuǎn)錄時采用特異性引物，在PCR擴增時使用特異性引物或隨機引物并加入熒光標記的dNTP。本研究的重點在于驗證所設(shè)計的屬級探針的適用性，所以采用了特異性引物進行RTPCR擴增來獲得標記產(chǎn)物，但從實際應(yīng)用角度考慮，應(yīng)選擇使用隨機引物來獲得標記產(chǎn)物，這需要進一步的試驗。另外，對于含量低的病原物，為了既能獲得足夠的標記產(chǎn)物，又減少特異性擴增每種病原物的繁瑣，可以采用屬級或科級簡并引物來進行PCR擴增。

4 結(jié)論

本研究通過屬級探針設(shè)計及標準樣品驗證，建立了可用于蘋果銹果類病毒屬類病毒篩查的芯片技術(shù)。該技術(shù)的建立將有助于主動式篩查該屬已知及未知的類病毒，為防止該屬類病毒的傳播擴散提供技術(shù)支持，從而為蘋果等產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供一定的保障。

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