優(yōu)雅蟈螽卵巢Piwi蛋白亞家族成員Giwi cDNA序列全長的克隆與生物信息學(xué)分析

劉靜 周志軍 常巖林

生殖干細胞（germline stem cells，GSC）是精巢和卵巢中配子發(fā)生的中樞，GSC的自我更新與分化在動物體內(nèi)保持平衡，從而使GSC和成熟配子的數(shù)量保持穩(wěn)定［1］。關(guān)于GSC的研究在模式生物果蠅中最為深入。Piwi基因廣泛存在于各種多細胞生物類群的干細胞之中。迄今為止，尚沒有關(guān)于其在半變態(tài)昆蟲中研究的報道。Lin和Spradling［2］首先在果蠅卵巢中發(fā)現(xiàn)piwi基因?qū)SC的分裂有調(diào)控作用。隨后，Cox等［3，4］證明piwi基因在果蠅雌性和雄性GSC中以自主方式表達并促進GSC分裂。Piwi蛋白通過與piRNA（Piwi-interacting RNA）結(jié)合形成Piwi-piRNA復(fù)合物引起基因沉默，進而對生殖細胞進行調(diào)控［5-7］。目前在多種生物（如人、小鼠、斑馬魚、線蟲）中都有果蠅piwi基因的同源基因發(fā)現(xiàn)，piwi基因的突變可導(dǎo)致生殖細胞發(fā)育缺陷［4，8-12］。

雖然近年來已對多種昆蟲的piwi同源基因進行了研究［13，14］，但昆蟲種類繁多，生殖方式多樣，生殖生理差異較大。已研究的果蠅、蜜蜂、家蠶均為完全變態(tài)類昆蟲，其卵巢管為滋養(yǎng)式（meroistic type），piwi基因在生殖干細胞龕（stem cell niche）的端絲和冠細胞中均有表達［4］，piwi基因突變導(dǎo)致GSCs過早丟失［15］。直翅目為不完全變態(tài)類昆蟲，其卵巢管是無滋式（panoistic type），卵子發(fā)生過程中沒有滋養(yǎng)細胞提供營養(yǎng)和信號［16］。無滋式的直翅目昆蟲卵巢是否存在調(diào)控GSC發(fā)育的因子，是否存在Piwi蛋白同源物，GSC發(fā)育的調(diào)控模式等尚無報道。

優(yōu)雅蟈螽（Gampsocleis gratiosa）隸屬于昆蟲綱（Insecta）直翅目（Orthopter）螽斯總科（Tettigonoidea），是直翅目重要的模式昆蟲。本研究利用piwi基因主要表達于生殖細胞的特點，通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNASeq）、RACE-PCR及相關(guān)生物信息學(xué)技術(shù)，對優(yōu)雅蟈螽雌性成蟲卵巢中piwi同源基因及預(yù)測的蛋白序列進行分析，為厘清無滋式卵巢管的原卵區(qū)（germarium）內(nèi)部細胞的組成及GSC龕模式在不完全變態(tài)昆蟲是否適用等問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試用的優(yōu)雅蟈螽采自河北省順平縣（38 83' N，115 13' E），將捕獲的末齡若蟲帶回實驗室內(nèi)飼養(yǎng)至成蟲。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 選取發(fā)育良好的優(yōu)雅蟈螽雌性成體，快速解剖取出卵巢置于含有RNAiso Plus（TaKaRa）的勻漿器中，充分研磨，進行總RNA提取。具體操作依照RNAiso Plus試劑盒說明書進行，提取獲得的總RNA溶解于RNase-free（TIANGEN）無菌水中。

1.2.2 引物設(shè)計 通過對本實驗室前期測得的優(yōu)雅蟈螽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行搜索，篩選出與昆蟲piwi基因同源的序列片段。由于piwi基因序列全長接近3 kb，因此將中間段序列分為A、B、C 3個互相重疊的片段進行引物設(shè)計。利用Primer Premier 5.0［17］軟件，共設(shè)計了3對中間段序列擴增引物（GAF/GAR，GBF/GBR，GCF/GCR）和4條基因兩端RACE引物（G3F1，G3F2，G5F1，G5F2）（表 1），并交由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 cDNA第一條鏈合成 用Oligo dT引物對總RNA（約1μg）進行反轉(zhuǎn)錄，具體操作依照Prime-Script?RT-PCR Kit（TaKaRa）試劑盒說明書進行。

1.2.4 piwi基因中間段序列RT-PCR 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，分別用GAF/GAR，GBF/GBR，GCF/GCR引物對進行擴增。擴增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

表1 RACE-PCR引物

1.2.5 piwi基因3'/5'端RACE-PCR反應(yīng) 3'RACE依照3'-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒說明書對總RNA（約1μg）進行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)程序：42℃ 60min，70℃ 15min。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用G3F1和3' Outer Primer及G3F2和3' Inner Primer分別進行Outer PCR擴增和Inner PCR擴增。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min（Outer PCR 20個循環(huán)/Inner PCR 30個循環(huán)）；72℃延伸10min。5' RACE依照5'-Full RACE Kit試劑盒說明對總RNA（約2μg）進行去磷酸化、去帽子、5' RACE Adaptor連接及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)程序：30℃ 10min，42℃ 1h，70℃15min。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用5' Outer Primer和G5R1及5' Inner Primer和G5R2分別進行Outer PCR和Inner PCR擴增（以上Outer Primer和Inner Primer均由TaKaRa公司試劑盒提供）。反應(yīng)程序同3' RACE。

1.2.6 克隆及測序 RT-PCR和3'/5'端RACE-PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶經(jīng)DNA片段凝膠回收試劑盒（北京三博遠志）純化、回收后，連接到pMD19-T載體（TaKaRa）上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。轉(zhuǎn)化后生成的菌落，通過藍白斑篩選，隨機選取3個陽性單克隆，交由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

1.2.7 生物信息學(xué)及系統(tǒng)進化分析 測序結(jié)果經(jīng)Lasergene［18］軟件校對、拼接獲得cDNA序列全長。使用NCBI中的ORFfinder程序進行開放閱讀框（ORF）及基因兩端非編碼區(qū)預(yù)測并推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列。運用BioEdit［19］進行多重序列比對，尋找PIWI結(jié)構(gòu)域活性催化模體。蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點及其它基本性質(zhì)的分析采用Prot Param［20］進行，二、三級結(jié)構(gòu)分別通過PROSITE［21］和Phyre2［22］軟件進行預(yù)測。采用 MEGA5［23］軟件基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 cDNA全長序列分析

將測序所得序列片段進行剪接，得到全長3 462bp的cDNA序列，GenBank序列登錄號為JX998175。該序列包含2 742bp的開放閱讀框，共編碼913個氨基酸殘基，5'非編碼區(qū)（5' UTR）111bp和3'非編碼區(qū)（3' UTR）609bp。預(yù)測的理論蛋白分子量為102.7kD，等電點為9.55。Giwi蛋白具備Piwi蛋白亞家族全部特征，C端的保守PIWI結(jié)構(gòu)域，中部的保守PAZ結(jié)構(gòu)域和N端可變結(jié)構(gòu)域（圖 1）。

2.2 序列比對及系統(tǒng)進化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取具有代表性的脊椎動物和截止2012年10月10日登錄的全部昆蟲Piwi蛋白亞家族序列，包括：斑馬魚Danio rerio（NP_89918-1.1、ABM46842.2）、 人 Homo sapiens（AAC97371.2、AAK92281.1、BAC81341.1、BAC81343.1、BAC813-42.1）、 小 鼠 Musmusculus（BAA93706.1、ABM691-81.1、AAN75583.1）、大鼠 Rattus norvegicus（NP_00-1102323.1）、埃及伊蚊 Aedes aegypti（XP_0016576-26.1、XP_001652831.1、XP_001652945.1、XP_0016-53082.1、XP_001663408.1、XP_001663409.1、XP_-001663870.1）、切葉蟻 Acromyrmex echinatior（EGI6-4222.1）、 意 大 利 蜜 蜂 Apismellifera（ACV84372.1、NP_001159378.1）、家蠶 Bombyxmori（NP_0010980-67.2、NP_001098066.2、BAF73718.2）、弓背蟻Camponotus floridanus（EFN67778.1）、致倦庫蚊 Culex quinquefasciatus（XP_001867947.1、XP_001844024.1、XP_001844067.1、XP_001844068.1、XP_0018470-30.1、XP_001860347.1、XP_001862491.1、XP_001-867946.1）、黑腹果蠅 Drosophilamelanogaster（ABO-26294.1、ABO27430.1、AAD38655.1、AAD08705.1、NP_476875.1）、大紅斑蝶 Danaus plexippus（EHJ69-790.1、EHJ75824.1）、印度跳蟻Harpegnathos saltator（EFN77932.1、EFN83189.1）、褐飛虱Nilaparvata lugens（AEI25513.1）、人虱 Pediculushumanus corporis（XP_002431988.1）、 赤 擬 谷 盜 Tribolium castaneum（EFA-02921.1、EFA07425.1）和優(yōu)雅蟈螽Gampsocleis gratiosa共47條。運用BioEdit進行多重序列比對分析，得出PIWI結(jié)構(gòu)域亦具有類似RNA酶H活性中心的DDH（Asp/Asp/His）三聯(lián)催化模體（圖1），3D模型中可見PAZ結(jié)構(gòu)域圍成的袋狀結(jié)構(gòu)，DDH催化位點深埋袋中（圖2）。

圖1 優(yōu)雅蟈螽giwi基因 cDNA核苷酸序列和氨基酸序列

用黑腹果蠅Drosophilamelanogaster Ago1（NP_725341.1）蛋白序列作為外群，采用NJ法構(gòu)建分子進化樹。結(jié)果（圖3）顯示，Piwi蛋白亞家族聚類形成兩個大的分枝A和B。分枝A，由28條昆蟲Piwi和Aubergine蛋白組成，雖然又可進一步劃分為兩個較小的分枝I和Ⅱ，但是這兩個分枝與Piwi和Aubergine蛋白并不對應(yīng)。例如：果蠅的Piwi和Aubergine蛋白都位于分枝I，而家蠶的Piwi和Aubergine蛋白，及本研究所獲得Giwi蛋白均位于分枝Ⅱ。分枝B，由7條昆蟲的Ago3、2條昆蟲的Piwi蛋白及11條脊椎動物的Piwi蛋白組成，可進一步劃分為3個較小的分枝III、IV和V。分枝III和IV分別由8條和3條脊椎動物的Piwi蛋白構(gòu)成；分枝V則由昆蟲的Ago3和2條昆蟲Piwi蛋白構(gòu)成，且與分枝IV形成姊妹群。

圖2 優(yōu)雅蟈螽Giwi預(yù)測蛋白的3D結(jié)構(gòu)

3 討論

本研究預(yù)測所得Giwi蛋白為Piwi蛋白亞家族成員。該家族蛋白進化保守，均含有C端的PIWI結(jié)構(gòu)域，中部的PAZ結(jié)構(gòu)域和N端的可變結(jié)構(gòu)域［24］。PAZ結(jié)構(gòu)域是小RNA結(jié)合區(qū)域，PIWI結(jié)構(gòu)域具有類似RNA酶H的DDH三聯(lián)催化模體，是行使切割功能的活性中心，與piRNAs的生成有密切關(guān)系［24，25］。通常認為含有活性DDH三聯(lián)催化模體的Piwi蛋白具有剪切活性或類剪切活性［24］。Giwi蛋白亦含有DDH三聯(lián)結(jié)構(gòu)，暗示該蛋白具有切割活性。

Piwi蛋白亞家族偏好表達于生殖系細胞，對生殖干細胞的自我更新和生殖系發(fā)育起著重要的調(diào)控作用［2，26］。該亞家族根據(jù)果蠅Piwi蛋白成員被分為三類 ：Piwi、Aubergine和 Ago3［27］。然而，本研究系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，昆蟲的Piwi和Aubergine在進化樹上位于相同的枝上，果蠅和家蠶的Piwi和Aubergine蛋白都沒有按照物種差異區(qū)分開來。有報道推測piwi和aubergine基因可能來源于遠古基因的重復(fù)事件［24］。脊椎動物的Piwi蛋白和昆蟲的Ago3蛋白在進化樹上亦沒有明顯的分開，Ⅴ號進化枝上的2個昆蟲Piwi蛋白指出該蛋白亞家族在命名過程中可能存在問題，以上問題有待進一步的研究來加以闡明。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于未知新基因的cDNA全長的獲得方法日新月異，包括基于構(gòu)建cDNA文庫法、基于通用簡并引物的RT-PCR法和計算機基因克隆法，又稱硅片克隆、電子克?。?8］。構(gòu)建cDNA文庫工作量較大，獲得的序列片段長度有限，且文庫覆蓋范圍有限［29］。通用簡并引物PCR法是根據(jù)數(shù)據(jù)庫中已有物種序列設(shè)計簡并引物進行擴增，方便簡單，但是由于個體內(nèi)通常存在同一基因家族的多個成員，而這些簡并引物在基因上的位置又經(jīng)常位于該基因家族的結(jié)構(gòu)域，因此，所獲得的測序結(jié)果往往是該基因家族的其他成員［30］。電子克隆依靠電腦和網(wǎng)絡(luò)資源，速度快、成本低是其最大的優(yōu)點，但電子克隆可依賴的EST序列有限，而且這些序列由于測序豐度的限制，有些序列甚至僅僅是單次測序結(jié)果，其精確性有待驗證［31］。本研究則在基于454高通量測序獲得的轉(zhuǎn)錄組序列的基礎(chǔ)上，篩選感興趣的目的功能基因，通過RT-PCR和RACE末端擴增技術(shù)克隆獲得該基因的cDNA序列全長。隨著高通量測序平臺的市場化，轉(zhuǎn)錄組測序成本的進一步降低，轉(zhuǎn)錄組測序的研究方法在分子生物學(xué)相關(guān)研究領(lǐng)域的應(yīng)用會更加廣泛。

4 結(jié)論

本研究以半變態(tài)昆蟲優(yōu)雅蟈螽為材料，通過對二代測序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行搜索，成功挑選出piwi基因的同源體并對其進行研究，得到giwi cDNA序列全長。序列分析預(yù)測所得Giwi蛋白具備Piwi蛋白亞家族全部特征。同源比對分析得到PIWI結(jié)構(gòu)域具有類似RNA酶H活性中心的DDH三聯(lián)催化模體。系統(tǒng)發(fā)育分析指出昆蟲的Piwi和Aubergine可能源于遠古基因的重復(fù)事件，Piwi蛋白亞家族在命名過程中可能存在問題，以上問題有待進一步研究。

圖3 優(yōu)雅蟈螽及其他Piwi亞家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

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