四翅濱藜Osmotin-like Protein基因的克隆、序列分析及其原核表達(dá)

王升陽 張勇 王健 劉言志 劉金亮 潘洪玉

植物抗病原物侵染反應(yīng)與多種生理生化調(diào)節(jié)相關(guān)，其中包括細(xì)胞壁木質(zhì)化、植物抗毒素的合成、病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，PRP）基因的表達(dá)，這些蛋白如幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶等。PRP根據(jù)序列相似性及免疫學(xué)相關(guān)性分為17個(gè)家族［1］，其中病程相關(guān)5（PR-5）蛋白是第5家族，具有β-1，3葡聚糖酶、抗真菌侵染、抗凍、抗?jié)B透壓力等多種生物學(xué)活性，參與植物系統(tǒng)獲得抗性（SAR）和過敏反應(yīng)（HR），在植物抵御生物和非生物脅迫中具有重要作用［2］。另外，PR-5蛋白與甜蛋白的氨基酸序列同源性高，也被稱為類甜蛋白（thaumatin-like protein，TLP）。同時(shí)，由于 PR-5 蛋白獨(dú)特的抗真菌活性，良好的穩(wěn)定性，而且對(duì)人體無毒，使它成為一種潛在的綠色抑菌藥劑。PR-5 蛋白包含了具有多種抗逆功能的滲調(diào)蛋白（osmotin）和類滲調(diào)蛋白（osmotin-like protein，OLP）。在植物體中，osmotin 是一種陽離子蛋白，OLP 與osmotin相比，pI偏低，并富含絲氨酸、蘇氨酸，可能使它在植物中具有不同的生理生化功能［3］。Osmotin最初作為在高濃度NaCl環(huán)境中培養(yǎng)的煙草細(xì)胞中主要積累的一種蛋白而分離得到［4］；許多研究已經(jīng)證明，OLP可被微生物侵染和多種非生物脅迫因素激活表達(dá)［5］。目前，盡管人們還不完全清楚OLP的生物功能，但是一些試驗(yàn)已經(jīng)證明OLP可作為一種抗真菌的體外蛋白［6］。目前，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)從大洋洲濱藜（Atriplex nummularia）、番茄（Lycopersicon esculentum）、阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）、野海茄（Solanum dulcamara）、辣椒（Capsicum annuum）等植物中克隆了osmotin-like protein基因。迄今為止，有關(guān)四翅濱藜o(jì)smotin-like protein基因的研究還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)從四翅濱藜的cDNA文庫中篩選出AcOLP基因，并對(duì)其進(jìn)行序列分析和原核表達(dá)的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

四翅濱藜cDNA文庫大腸桿菌菌株DH10B由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；大腸桿菌E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）菌株與表達(dá)載體pET-28a由本實(shí)驗(yàn)室提供；克隆載體pMD18-T Vector購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 文庫目標(biāo)克隆子的獲得 隨機(jī)挑選文庫克隆，提取質(zhì)粒DNA，以載體pYES-DEST52上游（T7）：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'和下游（R）：5'-AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3'為測(cè)序引物，進(jìn)行全序列測(cè)定得到EST序列，然后在NCBI BLASTX庫進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2 AcOLP基因的克隆及測(cè)序 根據(jù)目的基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)PCR擴(kuò)增特異性引物。上游引物：5'-CGGGATCCATGAATTCCTCCTTGATGAAAT C-3'，下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物：5'-CCCTCGAGTCAAGGACAAAATGTAACTAC-3'，下劃線為Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)。以四翅濱藜cDNA為模板進(jìn)行 PCR，反應(yīng)體系（25.0μL）為 ：ddH2O 18.0μL、10×Pfu PCR Buffer（含 Mg2+）2.5μL、Forward Primer 1.0μL、Reverse Primer 1.0μL、dNTPs 1.0μL、Template 1.0μL、Pfu 酶0.5μL。反應(yīng)程序?yàn)?：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30 s、72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測(cè)鑒定正確后，進(jìn)行回收，將回收的AcOLP基因片段進(jìn)行加“A”反應(yīng)后與pMD18-T Vector連接，連接反應(yīng)按照試劑盒說明書進(jìn)行，16℃條件下連接1h，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-AcOLP。連接產(chǎn)物用CaCl2化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，LB（Amp+）平板上37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑取平板上的單菌落，接種于LB（Amp+）液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和Xho Ⅰ雙酶切驗(yàn)證、PCR鑒定，將獲得的3個(gè)陽性重組質(zhì)粒送至Invitrogen公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比較和分析。

1.2.3 AcOLP基因的原核表達(dá) 用BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pMD18T-AcOLP、表達(dá)載體pET-28a分別進(jìn)行雙酶切，電泳檢測(cè)，回收，以T4 DNA連接酶于16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于50mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。按照上述方法對(duì)平板上挑取的菌落進(jìn)行酶切驗(yàn)證和PCR鑒定。將獲得的原核融合表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-AcOLP轉(zhuǎn)化BL21（DE3）受體菌株中。PCR和酶切驗(yàn)證正確后，挑取其陽性克隆接種于3mL含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，以1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600至0.4-0.6時(shí)，加IPTG至終濃度為1mmol/L，分別誘導(dǎo)0、2、4、6和8h。離心收集菌體，加入1/10體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸10min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

2 結(jié)果

2.1 四翅濱藜o(jì)smotin-like protein基因的克隆

以四翅濱藜cDNA為模板，用所設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，大約在700bp出現(xiàn)明顯特異性條帶（圖1）

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 序列測(cè)定與分析

2.2.1 結(jié)構(gòu)域和保守性分析 選取質(zhì)粒PCR鑒定表現(xiàn)出陽性克隆及酶切鑒定可以切出目的片段的菌株進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，AcOLP基因包含有全長為687bp開放閱讀框，編碼的多肽鏈含有229個(gè)氨基酸。將得到的序列提交GenBank，序列號(hào)為JN632587.1。以ExPASy網(wǎng)站的Compute pI/Mw tool計(jì)算可得AcOLP的等電點(diǎn)為6.04，分子量為24.07kD。在NCBI網(wǎng)站上對(duì)AcOLP基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行保守區(qū)域分析。分析結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)共有229個(gè)氨基酸殘基，屬于GH64-TLP-SF超家族，是一種病程相關(guān)5（PR-5）蛋白。推導(dǎo)的AcOLP氨基酸全長序列與其他植物中相關(guān)的PR-5蛋白序列的比對(duì)結(jié)果，如圖2所示。AcOLP含有17個(gè)Cys殘基，其中16個(gè)在PR-5蛋白中是高度保守的，可能與二硫鍵的形成有關(guān)［7］；在N端1-28氨基酸為預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列，可能與osmotin-like protein在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，信號(hào)肽的最后一個(gè)氨基酸為Ala，這在osmotin-like protein也是較為保守的［8］。

圖2 六種PR-5蛋白氨基酸序列比對(duì)圖

2.2.2 序列同源性分析 AcOLP與其他物種的相關(guān)序列有較高的同源性。核酸序列同源性分析表明，AcOLP基因與大洋洲濱藜o(jì)smotin-like protein基因（M84468.1）同源性最高，為94％；與其它植物如大米草（Spartina anglica）、西藏南美藜（Chenopodium quinoa）的osmotin-like protein基因的同源性也在81％以上。AcOLP基因編碼的蛋白序列與大洋洲濱藜o(jì)smotin-like protein蛋白（AAA32909.1）序列同源性達(dá)87％，與上述其他植物中的PR-5蛋白序列同源性基本都在50％以上。表明osmotin-like protein合成過程在植物進(jìn)化中屬于較保守進(jìn)化。

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析 利用MEGA5.05軟件對(duì)四翅濱藜、大洋洲濱藜、燕麥（Avena sativa）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、西藏南美藜等的PR-5蛋白序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖（圖3），可以看出，比對(duì)的PR-5蛋白被分成了兩大類，四翅濱藜與大洋洲濱藜的親緣關(guān)系最近，四翅濱藜、大洋洲濱藜、西藏南美藜比對(duì)的PR-5蛋白屬于類滲調(diào)蛋白（osmotin-like protein，OLP）。

圖3 四翅濱藜與部分物種PR-5蛋白氨基酸推導(dǎo)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 AcOLP基因原核表達(dá)

將鑒定為陽性的pET28a-AcOLP BL21（DE3）菌體經(jīng)過終濃度為1mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)0、2、4、6和8h。將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖4）表明在29kD處出現(xiàn)一條特異性蛋白帶，與預(yù)期大小一致，說明AcOLP基因編碼的蛋白在大腸桿菌中得到了正確的表達(dá)。并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，目的蛋白的表達(dá)量逐漸增加，到4h達(dá)最大值。

圖4 AcOLP在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)的SDSPAGE電泳圖

3 討論

我們從四翅濱藜cDNA文庫中克隆了AcOLP基因，測(cè)序結(jié)果和同源性分析表明該基因編碼蛋白屬于PR-5家族蛋白，同時(shí)將獲得的AcOLP基因連接到原核表達(dá)載體上誘導(dǎo)其原核表達(dá)。有關(guān)研究表明，osmotin-like protein能抵抗致病疫霉（Phytophthora infestans）的侵染，致病疫霉可引起馬鈴薯和番茄的晚疫病，但是目前還不清楚其高度保守的Cys是否與抗真菌作用有關(guān)。Osmotin-like protein可被多種非生物因素和生物因素所誘導(dǎo)，例如，ABA、SA、高濃度鹽溶液、機(jī)械損傷、低溫、真菌侵染，說明這種蛋白在滲透脅迫和抵御病原體侵染方面的雙重功能［9］。金屬陽離子影響PR-5蛋白與真菌細(xì)胞壁受體的作用。一種來源于煙草的PR-5蛋白o(hù)smotin，對(duì)其與酵母抑制作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞壁上聚甘露糖上的一個(gè)磷酸化位點(diǎn)是osmotin的受體［10］，而且其結(jié)構(gòu)中的酸性凹槽是osmotin作用位點(diǎn)，此外這2個(gè)位點(diǎn)都是帶負(fù)電荷。K+通過與磷酸基團(tuán)結(jié)合影響osmotin與它的結(jié)合，從而抑制osmotin 在菌體細(xì)胞壁上的識(shí)別；此外，Ca2+會(huì)與K+競爭結(jié)合受體，能促進(jìn)osmotin與磷酸基團(tuán)的互相結(jié)合，因而增強(qiáng) osmotin對(duì)菌體的毒性［11］。Osmotin-like protein較osmotin pI值偏低，因而可能具有更強(qiáng)的抗菌作用。而這一研究被運(yùn)用在草莓貯運(yùn)過程中，草莓被含Ca2+的溶液處理后，草莓在貯運(yùn)中的腐敗減少［12］，而且從草莓中發(fā)現(xiàn)的2個(gè)PR-5蛋白FaOLP［13］和FaOLP2［14］也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。因此，本研究結(jié)果為osmotin-like protein的體外活性測(cè)試和通過植物基因工程提高植物的抗病性研究提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從四翅濱藜cDNA文庫中擴(kuò)增并克隆了AcOLP基因，測(cè)序結(jié)果和同源性分析表明，osmotinlike protein基因在高等植物的PR-5蛋白基因間保守性較高，四翅濱藜和大洋洲濱藜的osmotin-like protein的N-信號(hào)肽序列完全一致。AcOLP中含有16個(gè)保守的Cys，與二硫鍵的形成有密切的關(guān)系，有利于AcOLP結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。將AcOLP基因與原核表達(dá)載體pET-28a連接，進(jìn)行融合表達(dá)，在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)出分子質(zhì)量約29kD的蛋白。

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