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    氣滯血瘀證大鼠NO/NOS體系的變化

    2013-09-13 07:27:16寧天一王婷婷程嘉藝
    世界中醫(yī)藥 2013年1期
    關(guān)鍵詞:灰階氣滯低劑量

    寧天一 王婷婷 姜 靜 程嘉藝

    (遼寧中醫(yī)藥大學(xué),沈陽(yáng),110032)

    氣滯血瘀證是指氣機(jī)阻滯而致血行瘀阻所表現(xiàn)的證候。常因情志不遂,閃挫外傷或寒邪內(nèi)阻等所引起。臨床表現(xiàn)胸脅脹滿或走竄疼痛,性情急躁,脅下痞塊,刺痛拒按,入夜更甚,或婦女痛經(jīng),經(jīng)色紫暗,夾有瘀塊,舌紫暗或有瘀斑等。氣是人體內(nèi)至精至微的生命物質(zhì),是生命活動(dòng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ),具有推動(dòng)血液的生成、運(yùn)行,以及津液的生成、輸布和排泄等功能。中醫(yī)“氣”的概念較難把握,但“氣”畢竟是物質(zhì)的,有其物質(zhì)基礎(chǔ)才能完成其重要功能。為了初步探討 “氣”的本質(zhì)與氣體信號(hào)分子的相關(guān)性,本實(shí)驗(yàn)復(fù)制氣滯血瘀病癥模型,觀察其模型體內(nèi)氣體信號(hào)分子NO的變化情況,研究是否與中醫(yī)理論中的“氣”存在相關(guān)性,為血瘀證及活血化瘀方藥的研究提供一個(gè)新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 試劑 NO試劑盒(20111123)、NOS試劑盒(20111123)(南京建成生物工程研究所),Trizol(D9108A)、RT-PCR試劑盒(DRR019A)、瓊脂糖(D601)、Marker(D526A)引物(寶生物工程(大連)有限公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)健康wistar大鼠,雌雄各半,體重180g~200g,隨機(jī)分成4組,分別為對(duì)照組、模型組、血府逐瘀湯低劑量組和高劑量組。

    1.3 復(fù)制模型 采用多因素聯(lián)合刺激法造模[1]。刺激因素包括聲、光、電、冰水浴、束縛、夾尾,每天刺激2次,持續(xù)5周時(shí)間。

    1.4 血漿NO含量測(cè)定 NO產(chǎn)生后在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化亞硝酸鹽(NO2-)和硝酸鹽(NO3-),而 NO2-又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO3-。利用硝酸還原酶特異性地將NO3-還原NO2-,通過(guò)顯色深淺測(cè)定 NO2-濃度高低[2]。

    1.5 肝組織TNOS和iNOS活性測(cè)定 按NO和NOS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作,測(cè)定NO合酶(TNOS)、誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)活性,結(jié)構(gòu)型NO合酶(cNOS)活性=TNOS活性-iNOS活性。

    1.6 RT-PCR法測(cè)定肝組織eNOS基因表達(dá) 參照文獻(xiàn)[3-4]采用 Trizol試劑提取總 RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件eNOS、β-actin退火溫度65℃。采用凝膠成像分析儀掃描,測(cè)定目的基因和β-actin擴(kuò)增的A,計(jì)算其與β-actin的比值,見表1。

    表1 eNOS和肌動(dòng)蛋白基因引物序列

    1.7 頸總動(dòng)脈eNOS免疫組織化學(xué)分析 頸總動(dòng)脈石蠟切片常規(guī)脫蠟水化,3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15min,微波法抗原修復(fù)10min,滴加一抗,4℃過(guò)夜,次日順序加入二抗和三抗,分別 37℃孵育30min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,光鏡下觀察eNOS在頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)情況[5]。用彩色病理分析系統(tǒng)測(cè)定eNOS陽(yáng)性細(xì)胞的著色灰階值?;译A值越小,說(shuō)明著色越深,反映eNOS表達(dá)量越多,以灰階值來(lái)進(jìn)行量化后行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 血漿和肝組織NO含量及肝組織中酶活性檢測(cè)與對(duì)照組相比,模型組血漿和肝組織中NO含量明顯降低(P<0.01),低劑量組血漿及肝組織中NO含量明顯高于模型組(P<0.05)。與對(duì)照組相比,模型組TNOS、cNOS活性均明顯降低(P<0.01),低劑量組TNOS、cNOS活性明顯高于模型組(P<0.05),見表2。

    2.2 肝組織eNOS基因表達(dá) 肝組織eNOS基因表達(dá)水平:與正常對(duì)照組相比,模型組肝組織eNOS基因表達(dá)水平明顯降低(P<0.01),低劑量組肝組織eNOS基因表達(dá)水平明顯高于模型組(P<0.05),見圖1。

    表2 氣滯血瘀證大鼠血漿及肝臟中NO含量及酶活性的變化(n=8,s)

    表2 氣滯血瘀證大鼠血漿及肝臟中NO含量及酶活性的變化(n=8,s)

    注:與對(duì)照組比較,**P <0.01;與模型組比較,△P<0.01,△△P <0.05。

    分組 劑量(生藥量/kg)血中NO(μmol/L)肝組織NO(μmol/mg)TNOS酶活性(U/mg)cNOS酶活性(U/mg)2.77±1.73 5.87±1.72 0.31±0.04 0.19±0.04模型組 0.52±0.33** 0.52±0.24** 0.19±0.02** 0.04±0.01**低濃度 15 2.37±0.53△△ 3.72±1.53△△ 0.24±0.02△△ 0.10±0.04△高濃度 15 1.88±1.04 2.26±1.28 0.22±0.02△△對(duì)照組0.04±0.05

    圖1 大鼠肝組織中NOS基因表

    2.3 頸總動(dòng)脈eNOS免疫觀察 與對(duì)照組比較模型組頸總動(dòng)脈eNOS灰階值明顯升高(P<0.05),與模型組比較低劑量組頸總動(dòng)脈eNOS灰階值明顯降低(P<0.05,見表3、圖2。

    圖2 大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NOS(×200)

    表3 氣滯血瘀大鼠肝組織eNOS蛋白表達(dá)(n=6,s)

    表3 氣滯血瘀大鼠肝組織eNOS蛋白表達(dá)(n=6,s)

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05。

    0.18±0.01模型組 6 0.27±0.03**低劑量組 6 15 0.21±0.07△高劑量組灰階值對(duì)照組組別 鼠數(shù)(只)劑量(mL/kg)6 15 0.22±0.05 6

    3 討論

    一氧化氮是一種化學(xué)性質(zhì)比較活潑的親脂性小分子化合物,在生物體內(nèi)由左旋精氨酸在NOS作用下最終生成,能夠持續(xù)產(chǎn)生并透過(guò)生物膜自由擴(kuò)散,具有舒張血管,降低血壓等生理功能,在心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用[6]。臨床上應(yīng)用硝基類舒血管藥物已有一百多年,隨著研究的深入,人們了解其作用機(jī)制,實(shí)際上是作為NO供體。硝基類舒血管藥物引起的血管舒張作用直接取決于NO的生成量,并存在量效關(guān)系,對(duì)血瘀證有治療作用的硝基類舒血管藥物本質(zhì)是通過(guò)氣體信號(hào)分子發(fā)揮作用[7]。氣滯血瘀證的形成是一個(gè)比較漫長(zhǎng)的過(guò)程,與情緒、飲食、年齡、環(huán)境、疾病等諸多因素有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為精神情志活動(dòng)是以臟腑所化生和貯藏的精氣血為物質(zhì)基礎(chǔ),而肝主疏泄在志為怒,怒以肝藏血為物質(zhì)基礎(chǔ),肝貯藏血液、調(diào)節(jié)血流量及防止出血有賴于肝疏泄氣機(jī)得以實(shí)現(xiàn)。本試驗(yàn)中大鼠經(jīng)多因素聯(lián)合刺激致使情志發(fā)生改變,長(zhǎng)期處于暴怒狀態(tài),從而建立了氣滯血瘀模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氣滯血瘀證NO含量和NOS表達(dá)水平明顯降低(P<0.01),給予行氣活血藥后NO含量和NOS表達(dá)水平顯著性增加(P<0.01),二者變化趨勢(shì)一致,這也驗(yàn)證了NO舒張血管功能,研究揭示行氣活血藥可以上調(diào)NO/NOS體系。有研究表明[8]機(jī)體組織缺血再灌注后內(nèi)皮功能受損,組織細(xì)胞會(huì)形成不可逆性損傷,組織缺血后eNOS活性、eNOS基因表達(dá)水平和NO含量均明顯降低,缺血組織恢復(fù)灌注后,eNOS活性、eNOS基因表達(dá)水平和NO含量低于基礎(chǔ)值,恢復(fù)灌注2 h,上述指標(biāo)接近基礎(chǔ)值,這是機(jī)體自我保護(hù)的一個(gè)過(guò)程。中醫(yī)理論中“氣”是存在于人體內(nèi)的至精至微的生命物,是生命活動(dòng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ),具有很強(qiáng)的活力,能夠推動(dòng)血液的生成、運(yùn)行,以及津液的生成、輸布和排泄等作用,存在生命物質(zhì)和生理功能雙重屬性。中醫(yī)關(guān)于“氣為血之帥,血為氣之母,氣行則血行,氣滯則血瘀”的論述,反映了氣血在生理病理方面的相互作用和相互致病的密切關(guān)系。進(jìn)一步深入探討氣的本質(zhì)和氣血關(guān)系,可以為治療血瘀證提供新的途徑,將對(duì)中西醫(yī)結(jié)合血瘀證的研究具有重要的意義。

    [1]王婷婷,賈乘,陳宇,等.大鼠氣滯血瘀證模型的建立及影響因素分析[J].中國(guó)中藥雜志,2012,37(10):1692 -1633.

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