徐長卿提取物對損傷內(nèi)皮細胞中乳酸脫氫酶、腫瘤壞死因子及白細胞介素-8活性的影響

李 陽 孫世光 謝予朋 孫曉迪 閆 薈 石亞飛

1.北京軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，北京 100700；2.河北北方學(xué)院研究生部，河北張家口 075000

徐長卿為蘿藦科多年生草本植物，《太平圣惠方》記載，徐長卿具有化瘀散結(jié)，降脂通絡(luò)等作用[1]。臨床上用于調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂，降低血脂、防治心腦血管動脈硬化[2]。攻膜復(fù)合物C5b-9的過度活化引發(fā)的內(nèi)皮細胞損傷是導(dǎo)致動脈粥樣硬化發(fā)生的主要原因[3]，前期實驗研究已確定了導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷的C5b-9臨界濃度，即C5b-9的亞溶破劑量，本文旨在研究徐長卿提取物對損傷內(nèi)皮細胞中炎癥介質(zhì)活性的調(diào)節(jié)作用，探究徐長卿治療動脈粥樣硬化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVEC（上海青忠貿(mào)易有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司），RPMI1640 培養(yǎng)基（Hyclone公司），補體 C5b-6、C8、C9（德國 Merck 公司），補體 C7（美國 Sigma公司），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白細胞介素-8（IL-8）試劑盒（南京建成），徐長卿藥材（購自吉林大藥房），丹皮酚標準品（北京藥品生物制品檢定所），標準酶標儀（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 徐長卿藥材有效成分提取 稱取徐長卿藥材適量，置于圓底燒瓶中，加入適量50%乙醇溶液，回流提取2 h，待提取液冷卻后二次回流提取1 h，放冷過濾，經(jīng)冷凍干燥后，得到藥材凍干粉。

1.2.2 內(nèi)皮細胞損傷模型的建立[4-7]前期應(yīng)用激光共聚焦顯微技術(shù)已確定了導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷的C5b-9的臨界濃度，現(xiàn)將該濃度的C5b-9組裝于內(nèi)皮細胞表面，具體過程如下：用2.5 mg/L的胰蛋白酶消化分離細胞，預(yù)熱無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細胞3次，1000 r/min，離心 5 min。 加入純品 C5b-6（1.6 mg/L，1 mL）和 C7（10 mg/L，1 mL），置于 37℃孵育 1 h。RPMI 1640洗去未結(jié)合的補體成分，加入 C8（10 mg/L，1 mL）和C9（10 mg/L，1 mL），置于 37℃孵育 1.5 h。 RPMI 1640洗去未結(jié)合的補體，將組裝好的細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中（每孔接種 1.5×104細胞），置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h，使細胞穩(wěn)定。

1.2.3 提取物對損傷細胞的作用 分別稱取適量藥材提取物凍干粉及丹皮酚標準品，用PBS緩沖溶液配制成高、中、低濃度溶液，分別用以上藥物處理細胞，同時設(shè)立空白對照及模型對照組。處理后細胞置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育96 h，收集細胞培養(yǎng)上清液。

1.2.4 測定上清液中各炎癥介質(zhì)的活性 按照試劑盒說明書，分別測定收集的上清液中LDH、TNF-α及IL-8的活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

細胞培養(yǎng)上清液中各炎癥介質(zhì)的分泌水平見表1。由表1可知，徐長卿提取物高劑量組及中劑量組與模型對照組比較，LDH、TNF-α及IL-8分泌水平差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但高劑量組中各炎癥介質(zhì)的分泌水平與空白對照組水平接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。丹皮酚標準品對照組與實驗組結(jié)果基本一致，其中中劑量組對LDH的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于高劑量組。

3 討論

早期研究已經(jīng)證實，徐長卿藥材中的主要成分為丹皮酚，占藥材總量的1%左右[8-9]。前期實驗研究得出50%乙醇提取可最大限度得到有效成分。趙霞等[10]通過研究丹皮酚對高脂血癥大鼠的膽固醇、三酰甘油等血象指標的調(diào)節(jié)作用，得知丹皮酚可調(diào)節(jié)主動脈組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，改善炎癥細胞因子的分泌；有研究指出，丹皮酚能夠抑制細胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生[11]，這可能對炎癥環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響；戴敏等[12]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可降低動脈粥樣硬化家兔血清中TNF-α含量，抑制兔血管平滑肌細胞的增殖；周曉慧等[13]指出，丹皮酚可抑制NF-κB信號通路，從而介導(dǎo)黏性分子的表達。本實驗以人體血管組織細胞人臍靜脈內(nèi)皮細胞作為實驗載體，建立內(nèi)皮細胞損傷模型，藥物干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn)，徐長卿藥材提取物可顯著降低炎癥因子LDH、TNF-α及IL-8的活性，進而修復(fù)內(nèi)皮細胞損傷，以達到治療動脈粥樣硬化的目的。實驗中設(shè)立丹皮酚標準品對照組，得出了與實驗組一致的結(jié)果，進一步證實了發(fā)揮主要治療作用的有效成分即為丹皮酚。

表1 各組上清液中各炎癥介質(zhì)分泌水平（±s）

表1 各組上清液中各炎癥介質(zhì)分泌水平（±s）

注：與空白對照組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；與模型對照組比較，**P ＜0.01；LDH：乳酸脫氫酶；TNF-α：腫瘤壞死因子；IL-8：白細胞介素-8；“-”表示無數(shù)據(jù)

空白對照組模型對照組提取物高劑量組中劑量組低劑量組丹皮酚高劑量組中劑量組低劑量組--1.60 0.80 0.40 0.20 0.10 0.05 117.85±1.65 200.49±3.31△△119.85±4.12**165.20±3.51△△**222.78±5.55△△123.53±4.80△**118.58±4.99**161.32±4.81△△**96.00±2.26 108.00±2.30△△94.75±3.19**92.81±1.78△**132.69±1.84△△98.42±0.90**105.56±2.15△△116.12±2.89△△30.88±2.50 40.98±0.60△△33.65±2.48**37.28±0.26△△**43.55±0.64△△31.52±1.20**37.12±1.37△△**37.95±0.97△△**組別 給藥劑量（g/L） LDH（U/L） TNF-α（ng/L） IL-8（ng/L）

內(nèi)皮細胞損傷發(fā)生后，可產(chǎn)生多種炎癥因子，常見的有LDH、TNF-α、IL-8等，這些炎癥因子可導(dǎo)致血管功能紊亂，阻斷局部血流供應(yīng)，使組織缺血缺氧壞死，進而加重內(nèi)皮細胞的損傷程度[14-16]。徐長卿中的主要有效成分丹皮酚可能干預(yù)這些炎癥因子的受體表達，以降低其活性，因此今后可從分子水平對該類基因的表達進行更深層次的研究。

[1]王顯.有關(guān)冠心病診療及研究的思考——動脈粥樣硬化“絡(luò)風(fēng)內(nèi)動”假說與實踐[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（3）：310-312.

[2]謝予朋，王顯，孫曉迪，等.絡(luò)衡方對高脂血大鼠血液流變學(xué)的實驗研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2012，28（6）：495-498.

[3]Ruth DL，Christopher LJ，Paul BM，et al.The membrane attack complex of complement drives the progression of athero sclerosis in apolipoprotein E knockout mice [J].Mol Immunol，2010，47（5）：1098-1105.

[4]Hadders MA，Bubeck D，Roversi P，et al.Assembly and regulation of the membrane attack complex based on structures of C5b6 and sC5b9[J].Cell Rep，2012，1（3）：200-207.

[5]Plumb ME，Sodetz JM.An indel within the C8α subunit of human complement C8 mediates intracellular binding of C8γ and formation of C8α-γ [J].Biochemistry，2000，39（42）：13078-13083.

[6]Chen Y，Zhang J，Guo G，et al.Induced B7-H1 expression on human renal tubular epithelial cells by the sublytic terminal complement complex C5b-9[J].Mol Immunol，2009，46（3）：375-383.

[7]吳佩澤，楊明會，楊雪梅.樹突狀細胞的補體攻膜復(fù)合物C5b-9 模型的建立[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2008，10（3）：19-21.

[8]趙麗萍.徐長卿研究進展[J].中國藥業(yè)，2011，20（2）：79-80.

[9]黃月純.徐長卿不同藥用部位的丹皮酚含量測定及揮發(fā)油成分分析[J].廣東藥學(xué)，2002，12（1）：19-20.

[10]趙霞，徐曉俊，李博，等.丹皮酚對實驗性高脂血癥大鼠的保護作用[J].中藥材，2010，33（8）：1312-1314.

[11]劉雁麗，韋柳成，沈振國，等.丹皮酚的藥理作用、提取及含量測定方法研究進展[J].安徽醫(yī)藥，2011，15（7）：896-899.

[12]戴敏，李后開.丹皮酚對動脈粥樣硬化家兔TNF-α含量及其誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖的影響[J].中國中醫(yī)藥科技，2007，14（1）：31-32.

[13]周曉慧，牛成偉，曹凱，等.丹皮酚通過抑制NF-κB信號通路下調(diào)高脂血清誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞黏附分子的表達[J].中國病理生理雜志，2011，27（2）：249-253.

[14]Schneiderman J， Schaefer K， Kolodgie FD， et al.Leptin locally synthesized in carotid atherosclerotic plaques could be associated with lesion instability and cerebral emboli[J].J Am Heart Assoc，2012，1（5）：e001727.

[15]Papadopoulou C，Corrigall V，Taylor PR，et al.The role of the chemokines MCP-1， GRO-α， IL-8 and their receptors in the adhesion of monocytic cells to human atherosclerotic plaques[J].Cytokine，2008，43（2）：181-186.

[16]楊承英.補體攻膜復(fù)合物C5b-9對人外周血單核細胞來源樹突狀細胞分化成熟及免疫學(xué)功能的影響[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2007.