樺褐孔菌醇對人胃癌BGC－823細(xì)胞周期的影響及其機制

崔 濤 鐘秀宏 孫艷美 趙麗微 楊淑艷 關(guān)曉輝

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 吉林 132011)

樺褐孔菌提取物樺褐孔菌醇(Inotodiol)對多種人類腫瘤均有較強的抗腫瘤作用〔1，2〕。本研究前期通過MTT細(xì)胞活性分析Inotodiol對人胃癌BGC-823細(xì)胞有較顯著的抑制作用，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測可呈劑量依賴性阻滯細(xì)胞于 S期〔3，4〕?；蛲蛔儭⑹Щ钜约斑^度表達(dá)或表達(dá)降低等可引起腫瘤細(xì)胞周期變化，而藥物如果作用過的腫瘤細(xì)胞在一定時間內(nèi)無法克服細(xì)胞周期阻滯時就會發(fā)生凋亡。因此，本實驗通過形態(tài)學(xué)觀察Inotodiol對人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的影響，然后通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測CyclinA、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和p21細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，以進一步探索Inotodiol對BGC-823細(xì)胞產(chǎn)生S期阻滯的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株BGC-823購自中科院上海細(xì)胞所。Inotodiol由河南大學(xué)藥學(xué)院趙芬琴博士提取并鑒定。胎牛血清(杭州四季青公司)，RPMI1640和0.25%胰酶(Gibco，美國);CyclinA、p21 抗體、PCNA(Santa Cruz，美國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 胃癌BGC-823細(xì)胞株生長于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，另加青霉素100 U/ml、鏈霉素100 g/ml，置于37℃、5%CO2及飽和濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待胃癌BGC-823細(xì)胞生長旺盛，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種細(xì)胞于6孔板或25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長到80% ～90%融合度時，吸盡培養(yǎng)液，實驗組加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基配制的不同濃度(20、40、80 g/ml)Inotodiol，對照組加入等量不含Inotodiol的無血清 RPMI1640培養(yǎng)基，共同培養(yǎng)48 h，備用。

1.3 光學(xué)顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞爬片，經(jīng)Inotodiol 80 g/ml作用48 h后，HE染色常規(guī)檢測。

1.4 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞爬片，經(jīng)Inotodiol 80 g/ml作用48 h后，加吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)混合液滴于蓋玻片上(避光)，在Olympus熒光顯微鏡下觀察，活細(xì)胞(VN)核染色質(zhì)綠色，呈正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)。早期凋亡細(xì)胞(VA)核染色質(zhì)綠色，呈固縮狀。晚期凋亡細(xì)胞(NVA)核染色質(zhì)橘紅色，呈固縮狀或破裂狀。壞死細(xì)胞(NVN)核染色質(zhì)橘紅色，呈正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)。隨機選擇3個不同高倍視野(×400)，細(xì)胞凋亡率(%)=(VA+NVA)/(VN+NVN+VA+NVA)×100%。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測 CyclinA、p21、PCNA蛋白的表達(dá) 終濃度為80 g/ml的Inotodiol作用于胃癌BGC-823細(xì)胞48 h后，在4℃條件下用冷丙酮固定10 min，按試劑說明進行SP法免疫細(xì)胞化學(xué)染色。判定標(biāo)準(zhǔn):以細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)呈清晰棕黃色為陽性細(xì)胞。隨機選取10個高倍視野，分別計數(shù)陽性細(xì)胞百分比。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Inotodiol誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)變化 HE染色光鏡觀察，對照組腫瘤細(xì)胞生長旺盛，呈不規(guī)則形，細(xì)胞核染色均勻，核仁清晰可見，核分裂像多見。實驗組腫瘤細(xì)胞體積縮小，呈圓形或不規(guī)則形，胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)濃縮，有的細(xì)胞膜起泡形成凋亡小體(圖1)。AO/EB熒光染色熒光顯微鏡下觀察，對照組腫瘤細(xì)胞大小形狀較單一，核染色質(zhì)呈綠色或黃綠色均勻熒光，胞質(zhì)呈橘紅色熒光。實驗組BGC-823胃癌細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小呈圓形，細(xì)胞周圍可見亮綠色或黃綠色熒光的圓形凋亡小體，胞核染色質(zhì)呈綠色或橘紅色，胞質(zhì)內(nèi)的橘紅色或橘黃色熒光減弱或消失。壞死細(xì)胞核染色質(zhì)呈橘紅色，胞質(zhì)膨脹或破裂(圖2)。80 g/ml樺褐孔菌醇作用BGC-823胃癌細(xì)胞48 h，凋亡率為25%(見表1)。

2.2 Inotodiol對BGC-823細(xì)胞 CyclinA、PCNA、p21表達(dá)的影響 80 g/ml Inotodiol作用于BGC-823細(xì)胞48 h后，與對照組相比，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinA、PCNA蛋白的表達(dá)減少和p21蛋白表達(dá)增加(P＜0.01，見圖3，表2)。

表1 兩組BGC-823細(xì)胞凋亡情況比較(n)

圖1 HE染色光學(xué)顯微鏡觀察BGC-823細(xì)胞凋亡(×400)

表2 兩組BGC-823細(xì)胞CyclinA、PCNA和p21表達(dá)比較(n=10，±s)

表2 兩組BGC-823細(xì)胞CyclinA、PCNA和p21表達(dá)比較(n=10，±s)

組別CyclinA PCNA p21對照組56.7±2.3 65.4.±2.7 19.2.±4.4實驗組 26.9±2.91) 26.9±3.21) 45.2±4.71)

圖2 AO/EB熒光染色熒光顯微鏡觀察BGC-823細(xì)胞凋亡(×400)

圖3 兩組胃癌BGC-823細(xì)胞CyclinA、PCNA、p21表達(dá)(×400)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，Inotodiol作用BGC-823細(xì)胞48 h后，除了對細(xì)胞增殖的影響外，在進行HE染色及AO/EB熒光染色中形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，Inotodiol有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

腫瘤是一種周期性疾病，腫瘤細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡都與細(xì)胞周期受阻密切相關(guān)，三者之間存在復(fù)雜和精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)〔5〕。Yuki等〔6〕的研究表明，樺褐孔菌提取物可誘導(dǎo) IMR90細(xì)胞阻滯于S期，并可引起細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡的變化，與κB受抑制有關(guān);Youn等〔7〕報道，樺褐孔菌提取物使肝癌HEPG2細(xì)胞阻滯于 G0/G1期，并通過抑制 CyclinD1，CyclinD2，CyclinE，CDK2，CDK6抑制腫瘤細(xì)胞生長。

CyclinA是S期細(xì)胞周期蛋白，屬于正向細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，關(guān)鍵作用是促進DNA合成。PCNA是一種酸性核蛋白，它是DNA聚合酶δ的一個附屬蛋白，它能在雙鏈DNA周圍形成一個滑動夾板，從而與DNA聚合酶δ相互作用，并使之持續(xù)合成DNA，PCNA在細(xì)胞周期的S期和G2期數(shù)量增高，因此，PCNA是DNA合成中的一個重要調(diào)節(jié)因子。而p21是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，能抑制PCNA的活性直接抑制DNA的合成〔8，9〕，高表達(dá)時可阻斷正常細(xì)胞周期進程。Inotodiol可能通過減少CyclinA、PCNA細(xì)胞周期蛋白的生成和上調(diào)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子p21的表達(dá)，影響細(xì)胞周期，致使產(chǎn)生S期阻滯，進而實現(xiàn)其對人胃癌BGC-823細(xì)胞的抗癌效應(yīng)。

1 Zhong XH，Wang LB，Sun DZ，et al.Effects of Inotodiol extracts from inonotus obliquus proliferation cycle and apoptotic gene of human lung ade-nocarcinoma cell line A549〔J〕.Chin J Integr，2011;17(3):218-23.

2 Zhong XH，Ren K，Lv SJ，et al.Progress of research on Inonotus obliquus〔J〕.Chin J Integr Med，2009;15:156-60.

3 崔 濤，鐘秀宏，楊淑艷，等.樺褐孔菌的不同提取物對胃癌BGC-823細(xì)胞株的生長抑制作用的體外觀察〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012;20(32):4442-3.

4 鐘秀宏，楊淑艷，孫東植，等.樺褐孔菌提取物誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的研究〔J〕.中國藥房，2007;18(34):2661-3.

5 Subbareddy M，Sudharsana RA，Soumya P，et al.Cell survival，cell death and cell cycle pathways are interconnected:implications for cancer therapy〔J〕.Drug Resistance Updates，2007;10(1-2):13-29.

6 Yuki Nakajima，Hiroshi Nishida，Seiichi Matsugo，et al.Cancer cell cytotoxicity of extracts and small phenolic compounds from chaga Inonotus obliquus(persoon)Pilat〔J〕.J Med Food，2009;12(3):501-7.

7 Youn MJ，Kim JK，Park SY，et al.Chaga mushroom(Inonotus obliquus)induces G0/G1 arrest and apoptosis in human hepatoma HepG2 cells〔J〕.World J Gastroenterol，2008;14(4):511-7.

8 Levin DS，Bai W，Yao N，et al.An interaction between DNA ligaseⅠ and proliferating cell nuclear antigen:implications for okazaki fragment synthesis and joining〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1997;94(24):12863.

9 Pan ZQ，Reardon JT，Li L，et al.Inhibition of nucleotide excision repair by the cyclin-dependent kinase inhibitor p21〔J〕.J Biol Chem，1995;270(37):220-8.