白藜蘆醇對(duì)大鼠缺血心肌的保護(hù)及對(duì)凋亡的抑制作用

何東偉 劉新偉 龐 勇 劉 柳 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，重慶 400016)

缺血再灌注損傷研究中，預(yù)處理和后處理均和減輕心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，即與細(xì)胞內(nèi)的Fas凋亡通路、線粒體凋亡通路等有關(guān)，但其確切的分子機(jī)制尚不清楚。白藜蘆醇是一種抗自由基、抗氧化劑，能預(yù)防、治療動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病，有助于血液流通，還能增進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中，心肌損傷的發(fā)生是多因素多途徑的，阻斷心肌損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和抑制參與多信號(hào)途徑的介質(zhì)是防治心肌損傷和細(xì)胞凋亡的最有效方法。磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷、抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用〔1〕。本研究觀察白藜蘆醇預(yù)處理對(duì)大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響與PI3KAkt信號(hào)通路的關(guān)系，探討白藜蘆醇保護(hù)缺血心肌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠50只，體重220～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要藥品、試劑、及儀器 白藜蘆醇購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司，渥曼青霉素、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)檢測(cè)試劑盒、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、免疫組化及Wester抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。動(dòng)物人工呼吸機(jī)DH-40，浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品，八導(dǎo)生理記錄儀(日本:RM6000)，日本光電公司產(chǎn)品。

1.3 研究方法

1.3.1 分組 將50只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(SH組)、缺血再灌注組(I/R組)、白藜蘆醇預(yù)處理組(Res組)、白藜蘆醇預(yù)處理+渥曼青霉素組(Res+Wom組)、缺血再灌注+渥曼青霉素組(I/R+Wom組)五組，每組10只。

1.3.2 模型制備 SD健康大鼠術(shù)前禁食6 h，在1.55 mol/L烏拉坦5 mg/kg靜脈麻醉，仰臥位固定大鼠，標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖監(jiān)測(cè)，連接氣管插管待開(kāi)胸后連接人工呼吸機(jī)(潮氣量20 ml/kg，頻率50次/min)。在胸骨左緣0.5 cm處縱行切開(kāi)第3～5肋，剪開(kāi)心包，暴露心臟，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，同時(shí)將一根直徑2 mm塑料管置于結(jié)扎線和冠狀動(dòng)脈之間，拉近結(jié)扎線使塑料管壓迫引起冠脈閉塞，造成急性心肌缺血模型，觀察心電圖，以出現(xiàn)QRS波群高大增寬為結(jié)扎成功的標(biāo)志。缺血45 min后，取出塑料管即再灌注，以QRS波群振幅逐漸回落為再灌注成功標(biāo)志，進(jìn)行再灌注120 min，假手術(shù)組的動(dòng)物手術(shù)全過(guò)程與其他組相同，但只穿線不結(jié)扎冠脈〔2〕。

1.3.3 給藥方法 (1)SH組:冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線，不結(jié)扎，穿線時(shí)及第46分鐘取下穿線時(shí)由舌靜脈注入生理鹽水1 ml;(2)I/R組:結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支45 min，造成急性心肌缺血模型，再灌注120 min，結(jié)扎時(shí)及再灌注前1 min由舌靜脈注入生理鹽水1 ml，余同SH組;(3)Res組:結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支45 min，造成急性心肌缺血模型，再灌注120 min，結(jié)扎時(shí)及再灌注前1 min由舌靜脈注入白藜蘆醇20 mg/kg，余同SH組;(4)Wom+Res組:結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支45 min，造成急性心肌缺血模型，再灌注120 min，結(jié)扎時(shí)及再灌注前1 min由舌靜脈注入白藜蘆醇20 mg/kg及渥曼青霉素，余同SH組;(5)Wom+I/R組:結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支45 min，造成急性心肌缺血模型，再灌注120 min，結(jié)扎時(shí)及再灌注前1 min由舌靜脈注入1 ml生理鹽水及渥曼青霉素，余同SH組。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定 (1)血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè):大鼠烏拉坦麻醉后，仰臥位固定，肝素化后(500 IU/kg)導(dǎo)管行右股動(dòng)脈插管檢測(cè)血壓，經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插管至左心室，連接至八道生理記錄儀，檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)，并重點(diǎn)記錄左心室收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左心室變化速率最大值(±dp/dtmax)在缺血前、缺血30、再灌注60、90、120 min幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化情況，并同步監(jiān)測(cè)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。(2)心肌組織NOS、NO含量的測(cè)定:NOS測(cè)定采用催化L-Arg比色法;NO采用硝酸酶還原法測(cè)定。(3)心肌凋亡細(xì)胞原位檢測(cè):再灌注結(jié)束，迅速剪下心臟，置于冰的PBS液中洗凈殘血，分離左心室前壁，于4%的多聚甲醛固定12 h，石蠟包埋。應(yīng)用TUNEL凋亡測(cè)試試劑盒嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。光鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核為深淺不一的棕褐色，每張切片于缺血部位隨機(jī)選取8個(gè)高倍視野(400倍)，分別計(jì)數(shù)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)并進(jìn)行匯總，以凋亡心肌細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比作為凋亡指數(shù)(AI)。(4)心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的免疫組化測(cè)定:每一標(biāo)本取2個(gè)不同部位的切片各2張，采用鏈酶親和素-生物素-酶復(fù)合物(SABC)免疫組化檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。以細(xì)胞質(zhì)著棕黃色為陽(yáng)性，用計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)，每次隨機(jī)選10個(gè)視野，測(cè)定細(xì)胞陽(yáng)性染色的OD值與陽(yáng)性細(xì)胞百分比，計(jì)算蛋白陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)(PEI)，并計(jì)算Bax和Bcl-2的比值。(5)Western印跡測(cè)定Akt及p-Akt的蛋白表達(dá):左心室心肌的缺血區(qū)，置于液氮中凍存后轉(zhuǎn)至－70℃存放。稱取凍存心肌樣品0.1 mg，冰浴，加入500 μl組織裂解液，冰浴勻漿，4℃，12 000 r/min 離心 10 min，收集上清50 μl應(yīng)用 BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。余下上清加入4倍上樣緩沖液，封閉后100℃水浴10 min，－70℃保存。以每個(gè)樣品的總蛋白為20 μg上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠為5%，分離膠為12%，120 V/140 V)，BioBad干轉(zhuǎn)儀(≤90 mA)轉(zhuǎn)膜至PVDF，2%脫脂奶粉封1h，一抗體封閉4℃過(guò)夜。PBST(PBS+Tween-20，1/1 000，v/v)洗膜15 min ×3 次;二抗(1∶4 000)37℃孵育1 h(羊抗兔)，PBST漂洗后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)，凝膠成像系統(tǒng)成像，應(yīng)用 UVP凝膠圖像處理系統(tǒng) Labwork4.6軟件分析目的條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，血流動(dòng)力學(xué)采用重復(fù)測(cè)定的方差分析，其余指標(biāo)采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)LVSP、LVEDP、±dp/dtmax的影響 見(jiàn)表1。

2.2 各組心肌組織中的NOS、NO的含量 見(jiàn)表2。

表1 白藜蘆醇對(duì)LVSP、LVEDP、±dp/dtmax水平的影響(±s ，n=10)

表1 白藜蘆醇對(duì)LVSP、LVEDP、±dp/dtmax水平的影響(±s ，n=10)

與I/R組比較:1)P＜0.05;與SH組比較:2)P＜0.05;與Res組比較:3)P＜0.05

SH組 I/R組 Res組 Res+Wom組 I/R+Wom組LVSP(mmHg)缺血前 114.44±7.65 113.55±7.05 114.17±6.82 113.97±6.59 112.98±6.65缺血30 min 113.27±7.43 100.71±7.192) 109.42±6.301)2) 101.05±5.782)3) 100.27±5.962)3)再灌注60 min 112.38±7.17 95.19±7.052) 104.75±6.751)2) 96.19±5.572)3) 94.16±5.152)3)再灌注90 min 111.75±7.01 91.34±6.972) 103.16±7.501)2) 92.65±5.672)3) 90.40±4.852)3)再灌注120 min 111.09±7.06 88.0±77.202) 101.53±8.191)2) 89.65±6.122)3) 86.99±4.732)3)LVEDP(mmHg)缺血前 4.44±1.58 4.52±1.36 4.09±1.80 4.15±1.13 4.42±1.35缺血30 min 4.81±1.60 9.47±1.382) 6.90±1.401)2) 8.71±1.292)3) 9.49±1.332)3)再灌注60 min 5.31±1.65 11.78±0.892) 7.96±1.771)2) 10.74±1.232)3) 12.17±1.422)3)再灌注90 min 5.60±1.59 12.72±0.922) 8.52±1.751)2) 11.66±1.262)3) 13.36±1.372)3)再灌注120 min 5.78±1.52 13.58±1.052) 9.05±1.671)2) 12.59±1.402)3) 14.51±1.042)3)dp/dtmax缺血前 4 192.46±303.35 4 165.52±256.17 4 104.45±270.47 4 208.00±217.06 4 081.65±276.152)3)缺血30 min 4 100.17±291.20 3 177.21±229.672) 3 665.85±266.251)2) 3 360.87±179.522)3) 3 084.91±274.312)3)再灌注60 min 4 049.17±293.54 2 887.65±266.352) 3 480.03±237.521)2) 3 074.13±141.452)3) 2 780.06±248.132)3)再灌注90 min 4 009.75±290.49 2 777.35±250.992) 3 422.85±231.991)2) 2 943.99±170.052)3) 2 681.93±259.872)3)再灌注120 m 3 960.75±280.06 2 672.18±247.502) 3 359.552±29.631)2) 2 842.00±143.622)3) 2 590.28±251.392)3)－dp/dtmax缺血前 －3 903.32±354.66 －3 843.79±292.58 －3 914.31±439.72 －3 933.29±362.35 －3 870.78±297.86缺血30 min －3 845.65±354.98 －3 061.15±279.702) －3 465.93±415.841)2)－3 098.50±242.432)3)－2 974.69±271.172)3)再灌注60 min －379 814±361.16 －2 925.75±289.912) －3 407.55±413.361)2)－2 974.37±247.842)3)－2 806.97±273.602)3)再灌注90 min －3 759.19±362.87 －2 847.64±302.352) －3 351.32±401.581)2)－2 902.35±240.762)3)－2 711.62±280.692)3)再灌注120 min －3 720.35±372.68 －2 775.87±300.852) －3 293.13±388.141)2)－2 831.53±248.162)3)－2 617.03±289.252)3)

表2 各組心肌組織中NOS、NO含量(±s ，n=10)

表2 各組心肌組織中NOS、NO含量(±s ，n=10)

與I/R組比較:1)P＜0.05;與Res組比較:2)P＜0.05

組別 NO(μmol/L) NOS(U/ml)SH組36.60±3.42 21.18±2.75 I/R組 18.38±3.90 11.35±2.00 Res組 51.49±5.321) 30.95±3.031)Res+Wom組 20.52±4.102) 12.64±2.452)I/R+Wom組 15.29±2.892) 10.32±1.982)

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞AI比較 TUNEL法染色陽(yáng)性的心肌細(xì)胞具有形態(tài)變圓或不規(guī)則、與周圍組織脫離、核固縮、染色質(zhì)濃聚等典型的凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征，主要位于心肌梗死區(qū)與非梗死區(qū)交界處，而在心肌梗死區(qū)和非梗死區(qū)內(nèi)僅見(jiàn)極少數(shù)散在凋亡細(xì)胞。與I/R組〔(17.25±2.51)%〕相比，Res組AI顯著降低〔(10.03±2.25)%，P＜0.05〕;Wom+I/R組與 Res組相比，AI顯著升高〔(17.70±2.32)%，P ＜0.05〕，Wom+I/R 組與I/R組相比 AI無(wú)顯著差別(P＞0.05)。Res+Wom組 AI(16.17±2.86)%較I/R組及Res組明顯增高(P＜0.05)。

2.4 各組心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的部位與凋亡細(xì)胞十分相似。與I/R組相比，Res組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，Bax/Bcl-2低于 I/R組(P＜0.05)，加入PI3K-Akt信號(hào)通路的特異性阻斷劑渥曼青霉素后，與Res組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，Bax/Bcl-2高于Res組。Res+Wom組與I/R組及Wom組相比，Bcl-2蛋白的表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，Bax/Bcl-2無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)(±s ，n=10)

表3 各組心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)(±s ，n=10)

與I/R組比較:1)P＜0.05;與SH組比較:2)P＜0.05;與Res組比較:3)P＜0.05

組別 Bcl-2 PEI(%)Bax PEI(%)Bax/Bcl-2 SH組14.1±1.8 15.4±3.1 1.5±0.5 I/R組 6.4±1.32) 14.7±2.52) 2.2±0.72)Res組 19.6±2.01)2) 13.5±2.71)2) 0.6±0.11)2)Res+Wom組 6.2±0.92)3) 13.6±2.6 2.1±0.52)3)I/R+Wom組 13.9±1.82)3) 15.2±2.82)3) 1.5±0.42)3)

2.5 各組總Akt及磷酸化Akt的表達(dá)量 各組總Akt差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與I/R組比較，Res組P-Akt蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05);與 Res組比較，Res+Wom組和I/R+Wom組P-Akt蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05)。見(jiàn)表4，圖1。

表4 各組大鼠T-Akt及p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較(±s ，n=10)

表4 各組大鼠T-Akt及p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較(±s ，n=10)

與I/R組比較:1)P＜0.05;與Res組比較:2)P＜0.05

組別T-Akt p-Akt I/R組3.8±1.8 0.82±0.32 Res組 3.7±2.2 1.98±0.431)Res+Wom組 3.9±2.1 0.62±0.222)Wom+I/R組 4.2±1.9 0.41±0.182)

圖1 各組大鼠總AKT及P-AKT的表達(dá)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)表明:LVSP、+dp/dtmax是與心肌收縮強(qiáng)度相關(guān)的指標(biāo)。+dp/dtmax是對(duì)心肌變力性干預(yù)十分敏感的指標(biāo)，在一定程度上受心率及前后負(fù)荷的影響并與其呈正相關(guān)。-dp/dtmax是心室收縮后左室內(nèi)壓快速下降期的最大下降速率，反映左室的舒張功能，是心肌缺血早期心室舒張功能改變的敏感指標(biāo)。若動(dòng)脈壓不變或降低，-dp/dtmax降低則表示左室舒張功能異常。當(dāng)左室舒張功能不全或回心血量增加，使LVEDP增高。心肌缺血期及再灌注期，上述各項(xiàng)心功能指標(biāo)均表現(xiàn)出異常:左心室峰壓(LVSP)、左室等容期壓力最大變化速率(±dp/dtmax)呈現(xiàn)進(jìn)行性下降，左室舒張末壓(LVEDP)不斷升高，給予白藜蘆醇后雖然不能使各項(xiàng)心功能指標(biāo)恢復(fù)正常，但可以降低缺血后LVSP、±dp/dtmax的降低幅度;同時(shí)可以對(duì)抗LVEDP的升高，但是應(yīng)用PI3K-Akt信號(hào)通路的特異性阻斷劑后，白藜蘆醇改善心功能的效果明顯降低(P＜0.05)。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡是心肌缺血時(shí)心肌損傷的主要形式，心肌細(xì)胞的凋亡程度決定了心肌梗死面積的大小〔3〕。急性心肌梗死再灌注治療，在梗死灶周圍可見(jiàn)凋亡細(xì)胞的存在，因此抑制細(xì)胞凋亡，改善心肌細(xì)胞的功能狀態(tài)對(duì)于防治心肌缺血再灌注損傷，促進(jìn)細(xì)胞存活有重要意義。白藜蘆醇預(yù)處理后，心肌組織中的NOS活性和NO含量上升，心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)量顯著下降。NO的信號(hào)內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以與細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞通路相互聯(lián)系，抑制 caspase-3裂解為 Bcl-2，從而減少細(xì)胞凋亡〔4〕。Bcl-2家族是主要的凋亡調(diào)控蛋白，包括 Bcl-2、Bax、Bcl-XL等，Bcl-2蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞生存，抑制細(xì)胞凋亡的作用，而Bax蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其中Bax與Bcl-2的表達(dá)比例是決定細(xì)胞是否凋亡的關(guān)鍵。心肌缺血再灌注損傷發(fā)生后，心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)下降。本實(shí)驗(yàn)提示白藜蘆醇減少心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax/Bcl-2的比值來(lái)實(shí)現(xiàn)的。NO還可以通過(guò)影響缺血再灌注過(guò)程中的炎癥反應(yīng)過(guò)程，減少心肌細(xì)胞壞死和凋亡〔5〕。

研究證實(shí)，部分心肌保護(hù)的作用機(jī)制最終依賴于Akt的活化〔6〕。PI3K-Akt保護(hù)心臟的機(jī)制中涉及多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)到介質(zhì)和效應(yīng)蛋白?；罨腁kt能作用于它下游的多個(gè)靶點(diǎn)，如NOS〔7〕、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病 2(Bc1-2)家族〔8〕、糖原合成酶激酶 3β(GSK-3β)、天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)、70 kd 核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)等，并可能最終通過(guò)減少線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)〔9〕的開(kāi)放，來(lái)改善線粒體能量的生成，保持線粒體外膜的穩(wěn)定性，減少促凋亡因子的活化等，發(fā)揮保護(hù)心肌功能，抗凋亡的作用。再灌注時(shí)mPTP的開(kāi)放是心肌損傷從可逆變?yōu)椴豢赡娴臉?biāo)志，其開(kāi)放的范圍決定再灌注損傷的程度。故延遲或阻斷心肌危險(xiǎn)區(qū)mPTP的開(kāi)放，可減輕心肌再灌注損傷。mPTP被認(rèn)為是缺血∕再灌注損傷中細(xì)胞死亡的關(guān)鍵事件〔10〕。mPTP是PI3K-Akt信號(hào)通路上的重要靶點(diǎn)，PI3K-Akt信號(hào)通路是參與細(xì)胞增殖調(diào)控的重要通路，是許多生命活動(dòng)中的關(guān)鍵信號(hào)分子，PI3K-Akt介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化、凋亡等活動(dòng)。

由此提示，白藜蘆醇對(duì)缺血再灌注心肌具有保護(hù)作用，能夠顯著抑制再灌注引起的細(xì)胞凋亡，而這種保護(hù)作用能被渥曼青霉素所阻斷，這種抑制可能與激活PI3K-Akt信號(hào)通路有關(guān)，而激活后的Akt具體是如何發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)，還需進(jìn)一步研究。

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