兔骨關(guān)節(jié)炎模型早期關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨生化改變及二磷酸鹽的干預(yù)效應(yīng)

陳海南 董啟榕 楊侃 姜偉

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種慢性、漸進(jìn)性、退行性關(guān)節(jié)病變。表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解失衡從而造成軟骨變性破壞，最后引起各種臨床癥狀［1］。近年來(lái)對(duì)其研究已從不同方面展開(kāi)，而關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的生化改變也逐漸成為熱點(diǎn)［2］。本研究通過(guò)建立兔骨關(guān)節(jié)炎(OA)早期模型，檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨退變過(guò)程中MMP-13的蛋白表達(dá)，軟骨下骨組織蛋白酶K(CK)、MMP-9的變化規(guī)律，同時(shí)用新一代二磷酸鹽作為干預(yù)因素，檢測(cè)其效果，為臨床防治該病患提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性新西蘭大白兔60只，體重(2.71±0.25)kg，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要設(shè)備試劑 二磷酸鹽(利塞磷酸鈉，Risedronate)(美國(guó)LKT laboratories Inc.)，鼠抗兔MMP-13單抗由武漢博士德公司提供，鼠抗兔MMP-9單抗由北京博奧森生物科技公司提供，鼠抗兔組織蛋白酶K(CK)一抗抗體由上海泛柯化學(xué)試驗(yàn)公司購(gòu)得。

1.3 模型復(fù)制及處理 所有動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(n=24)，模型組(n=24)，二磷酸鹽組(n=12)。二磷酸鹽組造模后每天皮下注射二磷酸鹽(利塞磷酸鈉，Risedronate sodium)0.01 mg/kg體重，模型組和對(duì)照組給以等體積的生理鹽水皮下注射。2% 戊巴比妥鈉按30 mg/kg麻醉，取髕骨內(nèi)側(cè)切口。模型組和二磷酸鹽組暴露前交叉韌帶，中間切除約5 mm。對(duì)照組同法暴露前交叉韌帶，不予切斷。術(shù)后5 d腹腔注射頭孢唑啉鈉500 mg/d預(yù)防感染。模型組和二磷酸鹽組分別在造模后4 W、8 W、12 W各取8只，對(duì)照組取4只空氣栓塞處死。截取包括股骨遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)面的骨段。進(jìn)行軟骨MMP-13免疫組化染色，軟骨下骨MMP-9和CK免疫組化染色。

1.4 關(guān)節(jié)軟骨MMP-13及軟骨下骨MMP-9，CK免疫組化染色檢測(cè) 取股骨內(nèi)側(cè)髁遠(yuǎn)端負(fù)重關(guān)節(jié)面軟骨用于MMP-13免疫組化染色，取軟骨下骨段(帶關(guān)節(jié)軟骨)用于MMP-9和CK免疫組化染色。標(biāo)本4%多聚甲醛固定，脫鈣，系列酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，層厚5 μm連續(xù)冠狀面切片。參照Pellerier［1］的方法在軟骨切片中隨機(jī)選擇6個(gè)高倍鏡視野(400倍)其中3個(gè)位于軟骨表層和中上層，另3個(gè)位于軟骨中下層和下層，計(jì)算每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。用細(xì)胞分?jǐn)?shù)即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比來(lái)表示MMP-13的表達(dá)量。軟骨下骨MMP-9，CK通過(guò)光鏡下觀察，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒且著色明顯高于背景者為陽(yáng)性。陽(yáng)性計(jì)數(shù):各組組織標(biāo)本切片，每間隔一個(gè)高倍視野選取一個(gè)視野進(jìn)行觀察，每張切片觀察5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目，取其平均值。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%為陽(yáng)性(-)，25% ～50%為弱陽(yáng)性(+)，50% ～75%為陽(yáng)性(++)，＞75%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，率的比較用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模術(shù)后不同時(shí)期關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP-13表達(dá) 模型組軟骨內(nèi)均可見(jiàn)較多的MMP-13表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。關(guān)節(jié)軟骨全層均見(jiàn)有MMP-13表達(dá)，為深棕褐色顆粒。4W時(shí)模型組MMP-13較正常和二磷酸鹽干預(yù)組明顯升高(P＜0.01)，而8W和12W較4W時(shí)反而有所下降。二磷酸鹽干預(yù)組，陽(yáng)性顆粒散在、顯色淺棕黃色。四周時(shí)對(duì)照組，模型組和二磷酸鹽組細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率為8%、94%和12%。和對(duì)照組相比，模型組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目明顯增多(P＜0.01)。二磷酸鹽可明顯抑制細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)。與模型組比較，二磷酸鹽組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目明顯減少(P＜0.01)，4W、8 W、12 W的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)平均數(shù)目見(jiàn)表1。從表中見(jiàn)到模型組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)平均數(shù)較對(duì)照組和二磷酸鹽組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明二磷酸鹽干預(yù)效果明顯。但隨著時(shí)間延后，MMP-13陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)逐漸減少。

2.2 造模后不同時(shí)期軟骨下骨MMP-9表達(dá) 各組軟骨下骨都有陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞漿內(nèi)有深淺不同的淺棕黃色到深棕褐色的顆粒，且著色明顯高于背景，模型組顯色深、有的聚集成簇，正常對(duì)照組和二磷酸鹽組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)少，散在，顯色淺。四周時(shí)對(duì)照組，模型組和二磷酸鹽組陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)目為分別為(1.34±0.1668)，(17.35±1.5430)，(3.34±0.1961)，細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率為4%、90%和16%。和對(duì)照組相比，模型組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目明顯增多(P＜0.01)，細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率也明顯升高(P＜0.01)。二磷酸鹽可明顯抑制細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)。與模型組比較，二磷酸鹽組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目和表達(dá)率均明顯減少(P＜0.01)，4W、8 W、12 W時(shí)的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)平均數(shù)目及表達(dá)率見(jiàn)表2。從表中見(jiàn)到模型組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)平均數(shù)及陽(yáng)性表達(dá)率均較對(duì)照組和二磷酸鹽組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說(shuō)明二磷酸鹽干預(yù)效果明顯。12W較4W時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明隨著時(shí)間延后，MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)逐漸減少。

2.3 造模后不同時(shí)期軟骨下骨組織蛋白酶K(CK)的表達(dá)變化 由各組數(shù)據(jù)及圖可見(jiàn)，各組軟骨下骨CK檢測(cè)都有陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，模型組胞漿內(nèi)見(jiàn)棕黃色到深棕褐色顆粒。正常對(duì)照組和二磷酸鹽組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)少。四周時(shí)對(duì)照組，模型組和二磷酸鹽組在高倍視野(×400)下陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)目分別為(1.66±0.1696)，(18.54±1.4180)，(4.05±0.1946)。細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率分別為8%、90%、12%。和對(duì)照組相比，模型組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目明顯增多(P＜0.01)，細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率也明顯升高(P＜0.01)。二磷酸鹽可明顯抑制細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，與模型組相比，二磷酸鹽組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目和陽(yáng)性表達(dá)率明顯減少(P＜0.01)。4 W、8 W、12 W時(shí)的CK陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目和表達(dá)率見(jiàn)表3，從表中見(jiàn)到模型組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目和陽(yáng)性表達(dá)率均較二磷酸鹽組及對(duì)照組高。組間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，CK表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，12 W時(shí)的表達(dá)較4 W時(shí)表達(dá)顯著減少(P＜0.01)?！纒)

表1 兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)不同時(shí)期軟骨MMP-13表達(dá)變化比較(x ± s，%)

表2 兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)不同時(shí)期軟骨MMP-9表達(dá)變化比較(

表3 兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨組織蛋白酶K表達(dá)變化(

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種退行性關(guān)節(jié)病，成為老年人群面臨的主要疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［3］。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的許多因素中生物學(xué)因素一直是研究的重點(diǎn)，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨各種成分的合成與分解平衡至關(guān)重要?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)廣泛存在于各種結(jié)締組織中，被分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素等五大類(lèi)，其中MMP-13廣泛存在于骨關(guān)節(jié)患者的關(guān)節(jié)軟骨和滑膜中，其裂解Ⅱ型膠原的作用是其他膠原酶的10-30倍，被認(rèn)為是裂解Ⅱ型膠原纖維作用最強(qiáng)的酶，在OA的形成中起關(guān)鍵作用。而且其他許多MMP亞型對(duì)Ⅱ型膠原的降解需要通過(guò)它們起作用［4］。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn) OA模型組MMP-13在術(shù)后4周時(shí)有強(qiáng)烈的表達(dá)，術(shù)后8周時(shí)表達(dá)逐漸減弱，12周時(shí)MMP-13表達(dá)繼續(xù)下降，說(shuō)明其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨降解作用減弱。MMP-13表達(dá)不隨軟骨退變加重而持續(xù)增強(qiáng)的原因目前尚不清楚，可能與其調(diào)控途徑不同有關(guān)。同時(shí)見(jiàn)到二磷酸鹽組有MMP-13的明顯減少，說(shuō)明利塞磷酸鈉對(duì)MMP-13的表達(dá)有明顯的抑制作用。增加Ⅱ型膠原的含量，改善軟骨結(jié)構(gòu)，從而改變了軟骨的退變進(jìn)程［5］。

MMP-9是明膠酶中的一個(gè)重要元素，它能夠?qū)⒛z原酶變性裂解的Ⅱ型膠原進(jìn)一步裂解。軟骨下骨的MMP-9來(lái)源于破骨細(xì)胞，當(dāng)其異常增多時(shí)表現(xiàn)軟骨下骨的過(guò)度吸收，引起軟骨下骨力學(xué)性能下降，抵抗外力作用下降，而同時(shí)產(chǎn)生的軟骨下骨代償性增生，又引起骨質(zhì)硬化，骨重塑增多。使軟骨下骨硬度不均勻，不能均勻傳導(dǎo)來(lái)自關(guān)節(jié)軟骨的沖擊力，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷［4］。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，模型組術(shù)后4W、8W、12W軟骨下骨MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目和陽(yáng)性表達(dá)率明顯較對(duì)照組和二磷酸鹽增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示OA模型早期破骨細(xì)胞增多，有明顯的骨吸收，二磷酸鹽組明顯抑制了MMP-9的表達(dá)，大體與組織學(xué)結(jié)果顯著好于模型組，顯示了二磷酸鹽通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)減少軟骨下骨的骨轉(zhuǎn)換，防止軟骨下骨重塑，減少骨硬化，進(jìn)而改善和維持關(guān)節(jié)軟骨的營(yíng)養(yǎng)代謝及生物力學(xué)環(huán)境。而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，8W、12W模型組的MMP-9陽(yáng)性表達(dá)數(shù)目和陽(yáng)性表達(dá)率逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示隨著OA的進(jìn)展骨吸收作用逐漸減弱，其機(jī)制仍不是完全清楚。

組織蛋白酶是破骨細(xì)胞分泌的一種溶酶體酶，其生理作用底物是有機(jī)骨基質(zhì)中含量豐富的ColI。它通過(guò)作用于ColI蛋白的N端及C端三股螺旋處而降解骨纖維膠質(zhì)，它對(duì)成骨膠原的降解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他各種金屬蛋白酶(MMPs)，是骨吸收過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。破骨細(xì)胞分泌的組織蛋白酶K的前體蛋白在骨吸收腔隙中被激活，參與骨質(zhì)的代謝。最近有報(bào)道組織蛋白酶K可能是哺乳動(dòng)物中唯一能降解骨纖維膠原的蛋白酶，CK的表達(dá)伴隨著整個(gè)破骨細(xì)胞分化的過(guò)程，由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收作用絕對(duì)或相對(duì)的增加超過(guò)成骨細(xì)胞的骨形成作用所導(dǎo)致的骨量持續(xù)丟失［6］。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，模型組術(shù)后4W、8W、12W組織蛋白酶K陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目和陽(yáng)性表達(dá)明顯增多，顯示關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨層破骨細(xì)胞增多，酶的表達(dá)增加，與MMP-9的表達(dá)類(lèi)似。顯示骨吸收作用下降。由于組織蛋白酶K對(duì)軟骨下骨吸收的明顯效能，因此對(duì)于如何抑制其骨吸收作用成為眾多學(xué)者的研究課題，Wittrant［7］等學(xué)者進(jìn)行的研究證明骨保護(hù)素是一種CK抑制劑。國(guó)內(nèi)學(xué)者在用中醫(yī)中藥方法抑制CK的骨吸收方面也取得了可喜的成績(jī)，他們用骨碎補(bǔ)總黃酮［8］、金雀異黃素［9］抑制CK的表達(dá)取得明顯效果。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中觀察到，二磷酸鹽利塞磷酸鈉組CK表達(dá)較模型組明顯減少(P＜0.01)，和正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，顯示其有明顯的抑制破骨細(xì)胞CK表達(dá)的作用，減少CK產(chǎn)生，減少軟骨下骨吸收，改善軟骨下骨力學(xué)性能。從而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。

［1］ Pelletier JP，Martel-Pelletier J，Howell DS.Etiopathogenesis of osteoarthritis.A Textbook of Rheumatology，2001，p:2195-245(chapter 110)．

［2］ Feuerherm AJ，Borset M，Seidel C，et al.Elevated levels of osteoprotegerin(OPG)and hepatocyte growth factor(HGF)in rheumatoid arthritis.Scand J Rheumatol，2001，30:229-234．

［3］ Hayami T，Pickarski M，Zhuo Y，et al.Characterization Of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruclate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthfitis．Bone，2006，38(2):234-243．

［4］ 王玉彬，陳安民，郭風(fēng)勁，等.基質(zhì)金屬蛋白酶家族在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中表達(dá)的研究.中國(guó)矯形外科雜志，2007，15(11):853-855．

［5］ 周輝，董剛，夏志敏，等.MMP.1、MMP-9 mRNA在創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá).中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2009，15(2):96-98．

［6］ Selingerc I，Day CJ，Morrision NA，et al.Optimized transfection of diced siRNA into mature primary human osteoclasts:inhibition of cathepsin k mediated bone resorption by siRNA.J Cell Biochem，2005(96):996-1002．

［7］ Wittrant Y，Couillaud S，Theoleyrd S，et al.Osteoprotegerin differentially regulates protease expression in osteoclast cultures.J Biochem Biophys Res Commun，2002，293:38-44．

［8］ 史曉林，劉康，吳連國(guó).骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松靶標(biāo)一組織蛋白酶K干預(yù)價(jià)值的探討．中國(guó)創(chuàng)傷骨科雜志，2008，16(5):70-72．

［9］ 王運(yùn)林，劉曉睛，楊菲，等.金雀異黃素抑制IL.-1α刺激破骨樣細(xì)胞的組織蛋白酶 K表達(dá)．中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)報(bào)，2006，28:473-476．