氯化甲基汞對(duì)K562和C6細(xì)胞存活率影響的比較研究

吳曉剛 張琨 李志超 孟令儀 宋昕恬

汞是重要的工業(yè)生產(chǎn)原料和產(chǎn)品，在工業(yè)中有廣泛用途，作為重金屬物質(zhì)，其生物學(xué)危害也一直被廣泛關(guān)注和研究。氯化甲基汞是汞化合物中被研究較多的物質(zhì)，現(xiàn)已證明其能夠誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生，改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+環(huán)境，影響蛋白質(zhì)的磷酸化，干擾線粒體功能以及DNA的復(fù)制［1］。近年來(lái)有學(xué)者提出用MMC為藥物治療白血病的新方法并取得進(jìn)展［2］，半胱氨酸與氯化甲基汞共軛結(jié)合有可能對(duì)抑制并殺傷腫瘤細(xì)胞有促進(jìn)作用。為進(jìn)一步研究氯化甲基汞及其共軛物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，本次試驗(yàn)選取K562和C6細(xì)胞作為研究對(duì)象，比較MMC及MMC-Cys對(duì)兩種細(xì)胞存活率的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 RPMll640、DMEM(Gibco)，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，MMC(Merck)，PBS、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，MTT、胰蛋白酶(Sigma)，K562及C6細(xì)胞株(ATCC)。CO2培養(yǎng)箱(Hepa)，倒置顯微鏡(奧林帕斯)，酶標(biāo)儀(Tecan)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2下培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d換液傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn);C6細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2下培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d胰酶消化傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè) 選擇MTT比色法檢測(cè)兩種細(xì)胞在不同藥物濃度下的細(xì)胞存活率，調(diào)節(jié)K562和C6細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，分別加入不同濃度的MMC和MMC-CYS，終濃度分別為2.5、5.0、10.0 μm/L，接觸時(shí)間分別為12 h、24 h，對(duì)照組不做處理。酶標(biāo)儀檢測(cè)，波長(zhǎng)分別為K562細(xì)胞490nm和C6細(xì)胞570nm，取平均值計(jì)算兩種細(xì)胞存活率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 K562細(xì)胞存活率的檢測(cè)結(jié)果 K562細(xì)胞藥物處理后12 h、24 h后，不同劑量組細(xì)胞存活率均顯著下降，MMC和MMC-CYS兩種處理因素對(duì)細(xì)胞存活率的影響差異無(wú)顯著性(P＞0.05)(見表1)。

2.2 C6細(xì)胞存活率的檢測(cè)結(jié)果 C6細(xì)胞藥物處理后12 h、24 h后，不同劑量組細(xì)胞存活率下降更為明顯，MMC和MMC-CYS兩種處理因素對(duì)細(xì)胞存活率的影響差異無(wú)顯著性(P＞0.05)(見表1)。

表1 MMC和MMC-CYS對(duì)K562和C6細(xì)胞存活率的影響(12 h)［±s(例，%)］

表1 MMC和MMC-CYS對(duì)K562和C6細(xì)胞存活率的影響(12 h)［±s(例，%)］

K562 C6劑量(μm/L)12 h 24 h 12 h 24 h MMC MMC-CYS MMC MMC-CYS MMC MMC-CYS MMC MMC-CYS±6.8 70.8±5.2 63.5±6.1 65.3±5.8 5.0 76.3±6.9 77.1±7.3 68.5±6.7 65.2±7.1 63.5±5.7 61.3±6.7 51.7±6.3 49.8±5.7 10.0 65.4±7.5 63.2±5.5 54.1±6.4 58.7±5.2 46.2.5 88.6±7.8 86.7±6.3 80.3±7.9 77.5±6.4 72.6 8±6.2 52.7±5.4 42.1±5.4 44.5±5.5

3 討論

在過去關(guān)于氯化甲基汞(MMC)的毒性研究中，已經(jīng)證明其損傷細(xì)胞的作用主要是因?yàn)榱己玫闹苄?，具有多靶點(diǎn)細(xì)胞毒效應(yīng)及放射效應(yīng)，能抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物［3］，改變線粒體膜電位，引起細(xì)胞凋亡［4，5］。在本次試驗(yàn)中，K562和C6細(xì)胞在加入MMC 12 h后，細(xì)胞存活率顯著下降，并且在較高劑量10.0 μm/L下降更為明顯，在加入受試物24 h后，細(xì)胞存活率下降更為明顯。在加入受試物MMC-CYS的試驗(yàn)組中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種細(xì)胞的存活率下降趨勢(shì)同樣顯著，并且與MMC組的存活率差異不明顯。在兩種細(xì)胞K562和C6的比較中，我們發(fā)現(xiàn)C6細(xì)胞更容易受到MMC的抑制作用，其細(xì)胞存活率下降更為顯著。

［1］ Ou YC，Thompson，Kirchener SC，et al.Induction of growh arrest and DNA damage-inducible genes Gadd45 and Gadd153 in primary rodent embryonic cells following exposure to methylmercury．Toxicol Appl Pharmacol，1997，147(1):31．

［2］ 劉秀華，費(fèi)秉元，等.氯化甲基汞-L-半胱氨酸共軛物誘導(dǎo)惡性腦膠質(zhì)瘤凋亡的體外研究．中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，16(4):579-581．

［3］ Hunter AM，Brown DL.Effects of microtubule-associated protein(MAP)expression on methylmercury-induced microtubule disassembly．Toxicol Appl Pharmacol，2000，166(3):203．

［4］ Munro IC，Nera EA，Charbonneau SM et al.Chronic toxicity of Methylmercury in rat．Environ Pathol Toxical，1980，(5-6):437．

［5］ Powis G，Kirkpatrick DL.Thioredoxin Signaling as a target for cancer therapy．Curr Opin Pharmacol，2007，7(4):392．