甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿有效部位對(duì)肝纖維化療效和 TGF-β1表達(dá)的影響①

王志旺 程小麗 郭 玫 王瑞瓊 邵 晶 任 遠(yuǎn) (甘肅中醫(yī)學(xué)院/甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730000)

罌粟科綠絨蒿屬植物是藏醫(yī)傳統(tǒng)用藥，《藏藥志》中記載綠絨蒿味甘、澀，性涼，具有清熱解毒、止痛利尿等功效，臨床用于治療頭痛、肝炎、肺炎、肝與肺的熱癥、水腫等病癥［1］，而藏醫(yī)藥以五脈綠絨蒿(Meconopsis quintuplinervia Regel，MQR)為其正品，在30多個(gè)藏藥復(fù)方中配伍使用。甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿主要分布于甘南高原、祁連山地及中部黃土高原的最高峰——馬銜山，本課題組前期研究顯示甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿及其中總黃酮具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎、體外抗氧化等作用［2，3］;本次研究設(shè)計(jì)了甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿醇提物、總黃酮與總生物堿及其混合物對(duì)CCl4復(fù)合因素致肝纖維化模型大鼠血清肝功能、肝纖維化指標(biāo)以及血清與肝組織中TGF-β1表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步闡明甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿抗肝纖維化的可能作用機(jī)理，為臨床用藥提供理論依據(jù)。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí) Wistar大鼠，體重180～220 g，雌雄兼用，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0001;SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)為SYXK(甘)2011-0001。甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿醇提物、總黃酮及總生物堿提取分離方法見1．2項(xiàng)下，分別精密稱取上述提取物適量，置研缽中，加入適量吐溫-80，采用干膠法按“油∶膠∶水 =2∶1∶2”的比例制備初乳，適當(dāng)稀釋即得甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿醇提物、總黃酮與總生物堿混合物、總黃酮、總生物堿的乳劑;另取適量吐溫-80制備1．5%的溶液作為對(duì)照液，冷藏備用。秋水仙堿，西雙版納版納藥業(yè)責(zé)任有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20110711。四氯化碳(CCl4)，廣東汕頭市西隴化工廠;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、羥脯氨酸(Hyp)與β1轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;即用型兔抗大鼠TGF-β1抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;722型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品;BS1103型Sartorius電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市正基儀器有限公司;PYXPHS-B型隔水式電熱培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;CH-212型光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社;BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司。

1．2 甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿各受試藥的制備 甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿全草購自甘肅省合作市藏醫(yī)院，經(jīng)甘肅省定西市臨洮農(nóng)校盧通寧高級(jí)講師鑒定。稱取藥材粗粉適量，用90%乙醇回流提取兩次，提取液減壓回收乙醇，并進(jìn)一步干燥即得乙醇提取物干浸膏(醇提物)。將醇提物溶于適量蒸餾水中，用石油醚萃除脂溶性較強(qiáng)的雜質(zhì)，殘留物用1 mol/L HCl溶液溶解，調(diào)pH值至2～3，過濾，濾液中主要含有生物堿，殘留物即為黃酮類粗品。將上述黃酮粗品用1 mol/L NaOH溶液溶解，調(diào)pH值至9～10，過濾，堿水層再用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取數(shù)次，合并乙酸乙酯，減壓濃縮即得五脈綠絨蒿總黃酮。將上述含有生物堿的酸性濾液用濃氨水調(diào)pH值至9～10，用氯仿萃取數(shù)次，分離氯仿層，回收氯仿即得五脈綠絨蒿總生物堿。將上述所得總黃酮與總生物堿按提取率混合即得甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿總黃酮與總生物堿提取物(黃堿提取物)。

1．3 動(dòng)物分組、造模與給藥 取SPF級(jí)Wistar大鼠88只，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按性別體重分層隨機(jī)分成8組，即A組(正常對(duì)照組)、B組(模型對(duì)照組)、C組(秋水仙堿組)、D組(五脈綠絨蒿醇提物組)、E組(五脈綠絨蒿總黃酮+總生物堿組，即黃堿組)、F組(五脈綠絨蒿總黃酮高劑量組)、G組(五脈綠絨蒿總黃酮低劑量組)以及H組(五脈綠絨蒿總生物堿組)。參照張萬國等［4］CCl4復(fù)合因素復(fù)制大鼠肝纖維化造模:除A組外，給大鼠皮下注射40%CCl4橄欖油溶液，每周2次，首劑量為5.0 ml/kg，以后每次劑量3.0 ml/kg，持續(xù)6周;造模第3、4周給予高脂、低蛋白質(zhì)復(fù)合飼料(玉米粉79．5%+膽固醇 0．5%+豬油 20%)，其余各周給予普通飼料;6周造模期間用20%乙醇作為唯一飲料。A組注射等量橄欖油，進(jìn)食普通飼料并自由飲水。各組大鼠從造模第1天起每天按表3所示劑量ig相應(yīng)藥物15 ml/kg，其中A組與B組給予對(duì)照液，每日一次，連續(xù)給藥6周。

1．4 指標(biāo)觀測與方法 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)每組11只大鼠，實(shí)驗(yàn)其間B組有1只大鼠體重迅速下降而死亡，C組與F組各有1只大鼠因灌胃不當(dāng)而死亡，其余85只大鼠完成實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)第6周，大鼠末次給藥24小時(shí)、禁食12小時(shí)、禁水6小時(shí)后，用2%戊巴比妥鈉麻醉，股靜脈采血，3 000 r/min離心10分鐘，分離血清，按試劑盒說明書檢測 ALT、AST、TGF-β1。處死大鼠，在肝右葉固定位置取肝組織2份，第一份采用免疫組化法對(duì)TGF-β1的表達(dá)進(jìn)行半定量分析:肝組織石蠟切片、TGF-β1免疫組織化學(xué)染色，染色過程中設(shè)陰性對(duì)照，陰性對(duì)照以PBS代替一抗，滴加二抗后DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，在鏡下每只大鼠選取2張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算肝臟組織中陽性物質(zhì)的吸光度，并計(jì)算出每個(gè)標(biāo)本的平均光密度值(OD值)。另一份肝組織制成肝干粉，參照試劑盒說明書測定肝組織Hyp含量，并按下列公式計(jì)算肝膠原蛋白含量。羥脯氨酸(μg/mg肝粉)肝膠原蛋白含量(μg/mg肝粉)=羥脯氨酸(μg/mg肝粉)÷13．4%。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用x±s的形式表示，應(yīng)用 SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05或P＜0.01視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿對(duì)肝纖維化大鼠血清ALT、AST及TGF-β1的影響 見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCl4復(fù)合因素在復(fù)制肝纖維化的過程中，大鼠血清酶與TGF-β1明顯升高，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組ALT與AST顯著升高(P＜0．01);甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿醇提物、黃堿組及總黃酮高、低劑量組大鼠血清ALT、AST與TGF-β1顯著降低，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，0.01)，且總黃酮的作用有一定的量效關(guān)系;同時(shí)發(fā)現(xiàn)生物堿對(duì)血清ALT、AST與TGF-β1的作用不明顯。

2．2 甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿對(duì)肝纖維化大鼠肝組織Hyp及膠原蛋白含量的影響 見表2。由表2可以看出，CCl4復(fù)合因素引起大鼠肝組織Hyp及膠原蛋白含量明顯增加(P＜0.01);甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿醇提物組、黃堿組、黃酮高劑量組與低劑量組能明顯降低Hyp及膠原蛋白的含量。同時(shí)隨著劑量的加大，甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿總黃酮的作用逐漸增強(qiáng)，顯示出一定的量效關(guān)系(P＜0．05)。

2．3 甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)的影響 見圖1和表3。肝組織免疫組化染色鏡下觀察:TGF-β1在正常對(duì)照組(Group A)大鼠肝臟細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，僅門靜脈周圍及小葉中央靜脈周圍等間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有少量表達(dá)，著色較淡(圖1A);模型對(duì)照組(Group B)TGF-β1廣泛表達(dá)于細(xì)胞核周圍的細(xì)胞漿內(nèi)以及匯管區(qū)、纖維間隔與肝竇壁，著色較強(qiáng)(圖1B);甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿醇提物組、黃堿組、黃酮高劑量組與低劑量組(Group D、E、F、G)TGF-β1 的表達(dá)不同程度減弱，在多見于匯管區(qū)和纖維間隔內(nèi)有少量陽性細(xì)胞，呈弱陽性著色(圖 1D、E、F、G);同時(shí)發(fā)現(xiàn)生物堿組(Group H)大鼠肝組織TGF-β1的表達(dá)范圍較廣，著色較強(qiáng)(圖1H)。對(duì)肝組織TGF-β1的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，其平均光密度值見表3，與模型對(duì)照組比較，甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿醇提物組、黃堿組、黃酮高劑量組與低劑量組TGF-β1的表達(dá)明顯減弱(P＜0.01)。

表1 甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿對(duì)肝纖維化大鼠血清ALT、AST及TGF-β1的影響 (x±s)Tab．1 Effect of MQR growing in Gansu Province on ALT，AST and TGF-β1 in serum of the liver fibrosis in rats(x±s)

表2 甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿對(duì)肝纖維化大鼠肝組織Hyp及膠原蛋白含量的影響(x±s)Tab．2 Effect of MQR growing in Gansu Province on Hyp and collagen protein in hepatic tissue of the liver fibrosis in rats(x±s)

圖1 甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)的影響(×40)Fig．1 Effect of MQR growing in Gansu Province on expression of TGF-β1 in hepatic tissue of the liver fibrosis in rats(×40)

表3 甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)的影響(x±s)Tab．3 Effect of MQR growing in Gansu Province on expression of TGF-β1 in hepatic tissue of the liver fibrosis in rats(x±s)

3 討論

肝纖維化是肝組織對(duì)慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是大多數(shù)慢性肝病共同的病理特征，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肝纖維化進(jìn)程可逆，預(yù)防和治療肝纖維化是肝病防治的重要環(huán)節(jié)［5］。CCl4為選擇性肝毒性藥物，在肝臟經(jīng)細(xì)胞色素P450激活為自由基·CCl3，后者與細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合，引起膜結(jié)構(gòu)與功能的破壞而導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，乙醇及其代謝物乙醛能夠直接誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(HSC)活化和膠原纖維的合成，高脂低蛋白飼料導(dǎo)致三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝失衡，因此，由CCl4、乙醇及高脂低蛋白飼料組成的復(fù)合因素復(fù)制大鼠肝纖維化模型成模率更高、成模時(shí)間更短、模型更加穩(wěn)定，尤其是與肝纖維化臨床病變過程具有較高的相似性，適用于肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的動(dòng)態(tài)觀察和研究［6，7］。本研究結(jié)果證實(shí)復(fù)合因素可成功誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肝臟Hyp以及膠原蛋白的含量明顯增加(P＜0.01);同時(shí)，模型對(duì)照組大鼠血清ALT與AST水平較正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)，提示復(fù)合因素使肝細(xì)胞受損明顯。對(duì)肝纖維化大鼠模型給予甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿醇提物、黃堿組以及總黃酮治療后，上述指標(biāo)得到了明顯的緩解，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，0.01)。

在肝纖維化發(fā)生過程中，轉(zhuǎn)化生長因子 β1(Transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)起重要調(diào)節(jié)作用［8］。1978年首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)并展開研究，現(xiàn)已證實(shí)TGF-β是一簇具有多種功能的蛋白多肽，目前至少發(fā)現(xiàn)有5種異構(gòu)體，分別為TGF-β1～5，對(duì)細(xì)胞的生長、分化與免疫反應(yīng)有廣泛的影響，其中TGF-β1是促進(jìn)肝纖維化最有效、最有力的因子。發(fā)生肝纖維化時(shí)，來源于肝臟的HSC、肝成纖維細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的TGF-β1與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體(TβR)結(jié)合，激活 Smad、細(xì)胞核因子 κB(NF-κB)和/或 PI3K/AKT等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將信息傳遞至細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)靶基因產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng):促進(jìn)HSC的增殖并分化為肌成纖維細(xì)胞(MFB)，促進(jìn)肝細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成并抑制其降解，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡并抑制其再生，抑制免疫細(xì)胞的免疫活性［9］。我們的研究也表明，在CCl4復(fù)合因素所引起的肝纖維化過程中，TGF-β1參與了肝纖維化的病理過程，甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿醇提物、黃堿組以及總黃酮能顯著抑制肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1的表達(dá)(P＜0.01);此外，有研究顯示，血清TGF-β1的水平與肝纖維化的程度呈正相關(guān)［10］，臨床上可以通過檢測血清TGF-β1的水平來了解肝纖維化的程度，本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿醇提物、黃堿組以及總黃酮可明顯降低肝纖維化大鼠血清TGF-β1的水平(P＜0.05，0.01)。

本次研究顯示甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿醇提物及其中的總黃酮對(duì)肝纖維化具有一定的保護(hù)作用，且總黃酮的作用體現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，而總生物堿的作用不明顯，提示甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿總黃酮是其保肝降酶、抗肝纖維化的主要有效部位，而抑制TGF-β1的表達(dá)是其抗肝纖維化的重要機(jī)制之一。

1 楊永昌．藏藥志［M］．西寧:青海人民出版社，1991:465-466．

2 王志旺，郭 枚，馬 駿et al．五脈綠絨蒿抗炎鎮(zhèn)痛作用有效部位的研究［J］．中國中醫(yī)藥信息雜志，2010;17(1):21-22．

3 王志旺，張 揚(yáng)，程 芳et al．五脈綠絨蒿總黃酮及其中苜蓿素的體外抗氧化活性［J］．中國老年學(xué)雜志，2011;31(22):4381-4383．

4 張萬國，胡晉紅．桑黃預(yù)防大鼠肝纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］．藥學(xué)服務(wù)與研究，2002;2(2):82-84．

5 Povero D，Busletta C，Novo E et al．Liver fibrosis:adynamic and potentially reversible process ［J］．Histol Histopathol，2010;25(8):1075-1091．

6 楊 華，張麗軍，馮艷玲et al．酒精復(fù)合性肝纖維化大鼠模型的建立及動(dòng)態(tài)觀察［J］．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2008;28(4):234-237．

7 Huang Q，Xie Q，Shi C C et al．Expression of angiotensin-converting enzyme 2 in CCl4-induced rat liver fibrosis［J］．Int J Mol Med，2009;23(6):717-723．

8 賈 杰，梁永紅．轉(zhuǎn)化生長因子β與肝纖維化的研究進(jìn)展［J］．醫(yī)學(xué)綜述，2008;14(21):3225-3226．

9 李志慶，蘇長青，楊家和et al．轉(zhuǎn)化生長因子β1在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及其靶向干預(yù)策略［J］．診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2011;10(4):375-379．

10 Feng X H，Derynck R．Specificity and versatility in TGF-β1 signalling through Smads［J］．Annu Rev Cell Dev Bio，2005;21(7):659-693．