重組溶葡萄球菌酶泡騰栓在母豬體內的藥動學與陰道內殘留消除研究

葉貴子 張幼定 陸 珉 李國棟,2 張繼恩孫永學 曾東平 陳 超 黃青山,4

（1昆山博青生物科技有限公司，江蘇省昆山市 215316；2上海高科聯(lián)合生物技術研發(fā)有限公司，上海市 201206；3華南農業(yè)大學獸醫(yī)藥理研究室，廣東省廣州市 510000；4復旦大學生命科學院遺傳學研究所遺傳工程國家重點實驗室，上海市 200433）

重組溶葡萄球菌酶泡騰栓在母豬體內的藥動學與陰道內殘留消除研究

葉貴子1張幼定1陸 珉1李國棟1,2張繼恩1孫永學3曾東平3陳 超3黃青山1,4

（1昆山博青生物科技有限公司，江蘇省昆山市 215316；2上海高科聯(lián)合生物技術研發(fā)有限公司，上海市 201206；3華南農業(yè)大學獸醫(yī)藥理研究室，廣東省廣州市 510000；4復旦大學生命科學院遺傳學研究所遺傳工程國家重點實驗室，上海市 200433）

通過雙抗夾心酶聯(lián)免疫學方法，采用藥代動力學軟件3p97，分別在健康和患陰道炎豬體進行重組溶葡萄球菌酶 （r LSP）藥代動力學及陰道黏液中活性研究分析，對靜脈注射r LSP的藥物濃度-時間數(shù)據(jù)進行最佳模型擬合。結果表明，健康和患陰道炎母豬經(jīng)靜脈注射r LSP（400 U）后，消除半衰期分別為36.10分鐘和40.36分鐘。健康和患陰道炎母豬經(jīng)陰道給藥r LSP泡騰栓 （400 U）后，試驗母豬血液中均未檢測到酶活性,說明r LSP經(jīng)陰道內黏膜吸收后在血液中沒有藥物蓄積。健康母豬和患病母豬在給藥后36小時陰道內黏液中均能檢測到酶活性 （分別為7.34 ng/mL和4.45 ng/mL），而在第48小時均未檢出，表明該藥物在陰道內至少保持36小時的活性，且作用48小時后無殘留。

r LSP泡騰栓；母豬陰道炎；藥代動力學；陰道內殘留

母豬陰道炎是母豬繁殖障礙病中的主要疾病之一，此病多發(fā)于產后，患豬若得不到及時有效的治療，往往會轉為隱性或慢性感染，致使泌乳量減少、無乳或乳汁質量差，不愿哺乳，哺乳仔豬拉稀，發(fā)育不良[1]。引發(fā)豬陰道炎的主要病原體有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、棒狀桿菌、霉菌及寄生蟲等[2]。預防和治療母豬產后陰道炎有利于規(guī)?；i場提高生產水平，增加養(yǎng)殖效益。調查結果顯示，母豬陰道炎發(fā)病率高，尤其規(guī)?；i場發(fā)病率可達到12%[3]，且治愈率低。豬呼吸與繁殖障礙綜合征的發(fā)生也大大增加了本病的治療難度。重組溶葡萄球菌酶 （rLSP）能夠迅速裂解和殺死大多數(shù)G+菌和部分G-菌，尤其對耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌（MRSA）等有較強的殺菌能力[3,4]，通常用于治療多種耐藥菌引起的感染[5,6]。國內張繼恩等[7]將rLSP應用到奶牛子宮內膜炎治療領域，并在臨床上取得很好的效果。但目前尚缺少相應的生物新型藥物治療母豬陰道炎。防治母豬陰道炎常用的方法是在飼料中添加藥物和給母豬注射抗生素，前者已經(jīng)在多個地區(qū)被禁用，而抗生素的耐藥性難題始終無法解決。為此新的替代物應運而生，如微生態(tài)制劑、中藥、酶制劑等。rLSP泡騰栓劑是一種以rLSP為主要成分的新型栓劑劑型，臨床用于治療母豬陰道炎[8]。

本研究使用rLSP泡騰栓分別對健康和患陰道炎母豬進行陰道給藥，對rLSP在血液中的藥動學和陰道黏液中的殘留情況加以研究，為闡明該藥物經(jīng)陰道內黏膜吸收后的體內藥動學、制定該藥物的最高殘留限量與休藥期提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥品與試劑

rLSP標準品 （0.575 mg蛋白/瓶，批號 20101201，純度≥98%），rLSP凍干粉 （400 U/瓶，批號 20110201），rLSP泡騰栓 （200 U/粒，批號20110401），上海高科聯(lián)合生物技術研發(fā)有限公司；辣根過氧化物酶 （HRP）、弗氏完全佐劑，Sigma公司；HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗鼠IgG，華美生物工程公司；96孔酶標板，Becton Dickinson Labware Europe公司；550型酶標儀，BIO-RAD公司；AKTA explorer、HiTrap Protein A親和層析預裝柱，Pharmacia公司；鄰苯二胺OPD，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；吐溫-20，上?；瘜W試劑公司；牛血清白蛋白 （BSA），上海伯奧生物科技有限公司。

1.1.2 試驗動物

新西蘭大白兔，雄性，2只，體重分別為2.32 kg和2.40 kg，第二軍醫(yī)大學試驗動物中心提供。

健康母豬和經(jīng)臨床診斷患有陰道炎的母豬各8頭，品質為二元雜長白，胎次均在第5～8胎之間，體重在175～186 kg之間，由廣東省原種豬場提供。

1.2 方法

1.2.1 抗體的制備、純化與簽定方法[9]

參照Huang[10]的方法進行抗體的制備、純化與鑒定。

1.2.2 夾心ELISA方法

參照小Huang[10]的方法進行夾心ELISA方法的建立。

參照陸錦春[11]的方法進行標準曲線的制作和方法靈敏度的測定。

1.2.3 添加回收率試驗

用正常豬血清和陰道內黏液配制成濃度為250、50、5 ng/mL的rLSP標準品溶液各3份作為樣品，離心后取上清液用雙抗夾心ELISA法檢測，根據(jù)其與標準曲線相應點的吸光值之比計算回收率。

1.2.4 藥物動力學試驗

1.2.4.1 給藥劑量

取健康母豬和經(jīng)臨床確診患陰道炎的母豬各8頭，正交設計后分別進行靜脈注射和陰道給藥。將400 U rLSP凍干粉用生理鹽水稀釋后經(jīng)耳緣靜脈注射給藥，將2粒200 U的rLSP泡騰栓使用特制陰道輸入器給藥。

1.2.4.2 動物分組和樣品采集

⑴血樣采集：所有試驗母豬在給藥前 （0時）和給藥后5、15、30分鐘，1、2、4、8、12、24小時經(jīng)前腔靜脈采血3mL，制備血漿，于-18℃保存待測；⑵陰道內黏液采集：陰道給藥的健康及患病母豬在給藥前，給藥后12、24、36、48、72小時使用滅菌用具從陰道內采集黏液約0.2～0.5 mL，于-18℃保存，待測陰道內黏液中rLSP活性。

1.2.4.3 樣品中酶活性檢測

血漿和陰道黏液中rLSP活性采用1.2.2建立的ELISA檢測方法進行樣品前處理與測定[11]。

1.2.4.4 數(shù)據(jù)分析

藥時數(shù)據(jù)采用中國藥理學會數(shù)學專業(yè)委員會編制的3p97藥代動力學程序軟件進行曲線擬合，采用Marquardt法對一、二、三房室分別以權重1、1/C、1/C2進行計算，根據(jù)殘差平方和WSS與最小AIC值判斷最適藥代動力學模型，并計算相應的藥代動力學參數(shù)。

2 試驗結果

2.1 夾心ELISA方法

2.1.1 標準曲線及靈敏度

以樣品吸光值的平均值A對樣品濃度對數(shù)值Lg（C）做直線回歸，得回歸方程 A=0.1273Lg（C）+0.1714，R2=0.9885。

分別讀取母豬血漿和陰道黏液3個空白對照孔的A值，計算其平均值及標準偏差 （S）。按照結果大于 （A+10S）判定為陽性，檢測下限分別為0.98 ng/mL和1.95 ng/mL。

2.1.2 添加回收率

用上述已建立的雙抗夾心ELISA法測定經(jīng)血漿、黏液稀釋的rLSP各濃度標準品的A值，根據(jù)其與標準曲線對應點的A值之比計算回收率 （表1），添加濃度為5、50、250 ng/mL，母豬血漿和陰道黏液平均回收率范圍分別為103.92%～115.81%和87.93%～93.36%，變異系數(shù)范圍分別為8.80%～12.53%和8.42%～11.48%，結果表明檢測方法可滿足分析要求。

表1 母豬血漿和陰道黏液中rLSP回收率和變異系數(shù) （n=3）

2.2 藥代動力學

2.2.1 健康和患病母豬靜脈注射給藥后血液中rLSP分析

所有給藥動物臨床未見異常反應，進食、呼吸、排泄等正常。母豬經(jīng)陰道給藥組在不同時間點采血檢測rLSP，結果均低于檢測下限。靜脈注射組檢測結果見表2。8頭母豬給藥前 （0小時）和給藥后240分鐘 （4小時）均未檢測到rLSP，給藥后5分鐘第一次采血檢測的rLSP濃度最高，說明藥物經(jīng)靜脈注射進入血液后吸收迅速。

表2 健康與患陰道炎母豬靜脈注射400 U rLSP的血液分析結果 （ng/m L）

對靜脈注射rLSP的藥物濃度-時間數(shù)據(jù)采用3p97軟件進行藥代動力學分析，主要動力學參數(shù)見表3，由表可知，健康和患病母豬經(jīng)靜脈注射400U rLSP后，消除很快，消除半衰期（t1/2Ke）分別為36.1分鐘和40.36分鐘，均小于0.7小時，與平均滯留時間 （MRT）相一致。

表3 健康與患陰道炎母豬靜脈注射400 U rLSP的主要動力學參數(shù)

表4 健康與患陰道炎母豬陰道給藥后黏液中rLSP分析結果 （ng/m L）

2.2.2 患病母豬經(jīng)陰道給藥后陰道黏液中rLSP分析

分別對健康母豬和患病母豬陰道內灌注400 U泡騰栓劑后,于不同時間點采集黏液檢測rLSP，檢測結果見表4。由表中可見健康母豬和患病母豬給藥后36小時陰道內黏液中均能檢測到rLSP，說明rLSP能在陰道內保持一定時間的活性，而在第48小時時黏液中殘留活性均低于檢測限，說明48小時后無藥物殘留。

3 結論與討論

當前國內外對母豬陰道炎的治療方法主要有消毒劑治療，抗生素注入，或者兩者相結合治療。消毒劑沖洗常用1 000 ppm高錳酸鉀或者500 ppm新潔爾滅沖洗陰道或者洗必泰栓給藥治療?？股刈⑷雵鴥戎饕猛撩顾刈⑷雱?，國外則通常在分離致病菌后進行藥物敏感性測試再選用四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、氨基糖苷類或呋喃類抗生素。消毒劑治療由于通常要進行大量沖洗，黏膜受刺激較大，外陰紅腫強烈且治療效果不佳?？股仡愃幬镏委煏种脐幍纼扔幸婕毦恼ＩL，破壞陰道內的微生態(tài)平衡，致病菌大量繁殖，增加了治療難度；更為嚴重的是，豬與人之間存在交叉感染，已經(jīng)引發(fā)了對于豬將成為人類MRSA感染宿主的擔憂，為此，養(yǎng)豬業(yè)急需治療母豬陰道炎的替代藥物出現(xiàn)。陸錦春[11]等研究了rLSP在患有子宮內膜炎奶牛體內的藥代動力學與殘留特征，其研究表明溶葡萄球菌酶在奶牛體內消除很快 （消除半衰期為29.945±1.844分鐘）。給健康或患病奶牛子宮內灌注高劑量rLSP，于不同時間點采集其血液、牛奶和子宮黏液進行含量檢測表明，經(jīng)子宮黏膜吸收后，血液和牛奶中沒有藥物蓄積；靜脈注射rLSP后不同時間點的牛奶中也沒有藥物蓄積，此結果推動了rLSP在奶牛子宮內膜炎治療方面的實施應用。本研究結果表明rLSP在母豬體內的藥動學和陰道內黏液中酶活性均有良好表現(xiàn)，這將推動rLSP泡騰栓劑在治療母豬陰道炎領域中的應用，有望成為有效的抗生素替代產品。

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1673-4645（2013）03-0056-03

2012-12-10