兩種電泳方法血紅蛋白分析一致性的比較

陳永秀，周云珍，陳錦宏，李樹全，龍桂芳

(1.橫縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 橫縣 530300;2.橫縣人民醫(yī)院產(chǎn)科，廣西 橫縣 530300;3.橫縣人民醫(yī)院血液科，廣西 橫縣 530300;4.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血紅蛋白研究室，廣西 南寧 530021)

地中海貧血是一類以珠蛋白α鏈或β鏈合成不足或缺失為特征的隱性遺傳性疾病。最常見為α-地中海貧血和β-地中海貧血，我國(guó)以南方地區(qū)多見，如廣西、廣東，四川、云南等地。開展地中海貧血檢測(cè)是臨床上診斷貧血必不可少的項(xiàng)目。目前很多基層醫(yī)院采用Sebia Hydrasys LC瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱瓊脂糖凝膠電泳)替代醋酸纖維素薄膜電泳對(duì)地中海貧血進(jìn)行篩查。為比較2種電泳方法的一致性，我們進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

材料和方法

一、一般資料

4126例臨床標(biāo)本來自2009年5月至2011年5月期間橫縣人民醫(yī)院門診和住院患者及其他體檢人員。男1862例，女2264例，年齡5個(gè)月～75歲。

二、儀器與試劑

1.瓊脂糖凝膠電泳 法國(guó)Sebia公司生產(chǎn)的Sebia Hydrasys LC全自動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)及其配套的HYRYS掃描系統(tǒng)，Hb瓊脂糖凝膠試劑、緩沖條、染色劑、紅細(xì)胞溶解液由法國(guó)SEBIA公司配套提供。脫色液(0.1%冰醋酸)自配。

2.醋酸纖維素薄膜電泳 北京市六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-2C型電泳儀及電泳槽，山東高密醫(yī)儀器公司生產(chǎn)的半自動(dòng)生化儀，自配的試劑(包括浸醋酸纖維素薄膜Tris緩沖液、硼酸緩沖液、麗春紅染色液、3%醋酸溶液，抗堿血紅蛋白測(cè)定用酸性半飽和硫酸銨溶液、NaOH溶液。)及具體操作按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)[1]進(jìn)行。

三、方法

1.瓊脂糖凝膠電泳 按儀器操作說明書進(jìn)行，將已用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝的靜脈血用生理鹽水反復(fù)洗滌3次處理，吸取10 μL壓積紅細(xì)胞進(jìn)行溶解，按說明書進(jìn)行操作，電泳、染色烘干后用HYRYS掃描系統(tǒng)掃描電泳膠片，對(duì)各條區(qū)帶進(jìn)行定量分析。

2.醋酸纖維素薄膜電泳 按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)[1]采用醋酸纖維素薄膜電泳檢測(cè) HbA、HbA2、HbH 、HbBart's、HbCS。將已用EDTA-K2抗凝的靜脈血用生理鹽水反復(fù)洗滌3次處理，用蒸餾水制成溶血液點(diǎn)樣電泳，微量醋酸纖維薄膜電泳觀察區(qū)帶。

3.HbF含量測(cè)定 用堿變性試驗(yàn)測(cè)定HbF含量。按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)[1]進(jìn)行。

4.其他試驗(yàn) H包涵體試驗(yàn)、異丙醇試驗(yàn)、紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)(一管法)、血常規(guī)檢查。2種電泳方法檢測(cè)不一致的樣本送廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血紅蛋白研究室進(jìn)行基因分析確診。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

兩樣本率比較用χ2檢驗(yàn)。

結(jié) 果

一、2種電泳方法在β-地中海貧血篩查中的比較

4126例樣本中瓊脂糖凝膠電泳共檢出β-地中海貧血 686例，檢出率為 16.63%，其中單HbA2增高 574例、單 HbF增高 47例、HbA2+HbF同時(shí)增高65例。醋酸纖維素薄膜電泳檢出β-地中海貧血683例，檢出率為16.55%，其中單HbA2增高 572例、單 HbF增高 49例、HbA2+HbF同時(shí)增高62例。對(duì)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出HbF增高(＞3%)的樣本采用堿變性試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)檢，二者結(jié)果基本一致。2種電泳方法對(duì)HbA2和HbF增高的檢出情況見表1、2。

表1 2種電泳方法對(duì)HbA2升高的檢測(cè)一致性比較(例)

表2 2種電泳方法對(duì)HbF升高的檢測(cè)一致性比較(例)

二、2種電泳方法在α-地中海貧血篩查中的比較

4126例樣本中瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)共檢出α-地中海貧血(HbA2降低)321例，檢出率為7.78%;醋酸纖維素薄膜電泳檢出α-地中海貧血(HbA2降低)323例，檢出率為7.82%。2種電泳方法對(duì)HbA2降低的檢出情況見表3。

三、2種電泳方法對(duì) HbH、HbBart's、HbCS區(qū)帶檢出率的比較。

2種電泳方法對(duì)HbH、HbBart's、HbCS區(qū)帶的檢出情況見表4～6。瓊脂糖凝膠電泳對(duì)HbH、Hb-Bart's和 HbCS區(qū)帶的檢出率分別為 2.50%、1.72%和1.52%;醋酸纖維素薄膜電泳分別為3.42%、2.45%和1.58%。經(jīng)基因分析確診，瓊脂糖凝膠電泳漏檢HbH 38例、HbBart's 30例、HbCS 2例。2種方法對(duì)HbH和HbBart's區(qū)帶的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，對(duì)HbCS區(qū)帶的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 2種電泳方法對(duì)HbA2降低的檢測(cè)一致性比較(例)

表4 2種電泳方法檢出HbH區(qū)帶的一致性比較(例)

表5 2種電泳方法檢出HbBart's區(qū)帶的一致性比較(例)

表6 2種電泳方法對(duì)HbH、Hb Bart's、HbCS區(qū)帶的檢測(cè)率比較[例(%)]

觀察瓊脂糖凝膠電泳漏檢的38例HbH、30例HbBart's區(qū)帶圖譜可發(fā)現(xiàn)HbA2區(qū)帶大多淡染、HbH及HbBart's區(qū)帶呈淡藍(lán)色，散在云霧狀，而醋酸纖維素薄膜電泳區(qū)帶清淅。38例瓊脂糖凝膠電泳漏檢的HbH病經(jīng)送廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血紅蛋白研究室進(jìn)行基因分析確診，全部為缺3個(gè)α基因中間型α地中海貧血HbH病。見表7。其中6例2種方法的區(qū)帶圖譜見圖1。

表7 2種方法檢測(cè)不一致的38例HbH病樣本基因分析結(jié)果

圖1 全自動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳漏檢的部分HbH區(qū)帶與HbBart's區(qū)帶圖譜

三、其他試驗(yàn)結(jié)果

4126例樣本中H包涵體試驗(yàn)陽性149例、異丙醇試驗(yàn)陽性273例、紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)(一管法)陽性 1206例、紅細(xì)胞平均體積(MCV)≤80 fL且平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)≤25.0 pg 3672例。

討 論

瓊脂糖凝膠電泳法是根據(jù)不同Hb分子所帶電荷不同，在電場(chǎng)中遷移率不同而達(dá)到分離Hb不同成份目的。經(jīng)染色、脫色、固定，在一定波長(zhǎng)下可掃描定量出各組分的百分比。在堿性pH值條件下，用瓊脂凝膠為載體，可分離出正常的Hb中的 HbA、HbA2、HbF 等成份[2]。瓊脂糖凝膠電泳較醋酸纖維素薄膜電泳分辨力強(qiáng)、區(qū)帶整齊、吸附小[3]，且在全自動(dòng)掃描儀上掃描定量，可避免人工操作帶來技術(shù)上的誤差，保證血紅蛋白電泳各區(qū)帶定量的準(zhǔn)確性[4]。醋酸纖維素薄膜電泳對(duì)HbF的分辨有一定的限制，所以電泳的同時(shí)需要用HbF堿變性試驗(yàn)測(cè)定HbF含量，步驟比較繁瑣。使用法國(guó)Sebia-Hydrasys LC全自動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，當(dāng)HbF＞3%時(shí)HbA區(qū)帶與HbF區(qū)帶分離得較開，掃描HbF定量比較方便、準(zhǔn)確，既能直接用肉眼觀察HbA2是否增高，又可掃描HbA2含量;能嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，減少人為誤差，結(jié)果準(zhǔn)確。HbF增高的病例也可直接掃描HbF含量，從而代替HbF堿變性試驗(yàn)[5]。瓊脂糖凝膠電泳能準(zhǔn)確分離各種區(qū)帶，圖譜可永久保存[6];而醋酸纖維素薄膜較脆，容易破碎，區(qū)帶顏色容易脫，不易保存。

然而，對(duì)于HbH和HbBart's區(qū)帶，醋酸纖維素薄膜電泳的分離能力強(qiáng)于瓊脂糖凝膠電泳，可清淅地分離出HbH區(qū)帶與HbBart's區(qū)帶。本研究結(jié)果顯示瓊脂糖凝膠電泳檢出的103例HbH及71例HbBart's區(qū)帶用醋酸纖維素薄膜電泳全部檢測(cè)出來，并多檢出了38例HbH及30例Hb-Bart's區(qū)帶。38例HbH病經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血紅蛋白研究室進(jìn)行基因分析確診，全部為缺3個(gè)α基因中間型α地中海貧血HbH病。瓊脂糖凝膠電泳未檢出HbH及HbBart's區(qū)帶的原因可能是HbH及HbBart's是一種不穩(wěn)定的血紅蛋白，很容易受外界因素的影響如溫度、電壓及緩沖液等破壞，使其無法分離或分離不清，染色后出現(xiàn)HbH及HbBart's區(qū)帶淡染，區(qū)帶分離不清就會(huì)導(dǎo)致掃描不出HbH、HbBart's區(qū)帶，造成漏診。在2種電泳方法檢出的141例α-地中海貧血中，發(fā)現(xiàn)了以下的情況:(1)HbA2區(qū)帶定量降低;(2)紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)陽性;(3)異丙醇試驗(yàn)陽性;(4)血常規(guī)檢測(cè)中 Hb含量降低、MCV、MCH降低;(5)觀察瓊脂糖凝膠電泳漏檢的38例HbH、30例HbBart's的圖譜區(qū)帶，發(fā)現(xiàn)HbH及HbBart's區(qū)帶呈淡藍(lán)色，散在云霧狀。目前很多基層醫(yī)院使用瓊脂糖凝膠電泳篩查地中海貧血，認(rèn)為醋酸纖維素薄膜電泳使用不便，不用醋酸纖維素薄膜電泳進(jìn)行復(fù)檢。因此建議在使用瓊脂糖凝膠電泳篩查地中海貧血時(shí)，如發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象應(yīng)采用醋酸纖素維薄膜電泳復(fù)檢，比色定量測(cè)定HbH及HbBart's區(qū)帶，以免漏檢。

總之，瓊脂糖凝膠電泳篩查地中海貧血具有簡(jiǎn)便、快捷、多數(shù)區(qū)帶定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)部分HbH及HbBart's區(qū)帶卻不能準(zhǔn)確檢出，應(yīng)注意結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)陽性現(xiàn)象以避免漏檢HbH病。另外，電泳方法只能檢測(cè)出HbH中間型及部分輕型地中海貧血，而有些輕型地中海貧血檢測(cè)不出，因而必須配合其他實(shí)驗(yàn)室檢查及做家系調(diào)查。在群體篩查和普查地中海貧血時(shí)可以使用血紅蛋白電泳方法，但在臨床確診和產(chǎn)前診斷時(shí)必須做地中海貧血基因分析。

[1]葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].第3版.南京:東南大學(xué)出版社，2006:180-184.

[2]王 泓，李 磊，王 霞，等.SEBIA-HYDRASYS電泳系統(tǒng)在血紅蛋白電泳檢測(cè)中應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)，2008，34(3):183-184.

[3]張秀明，李健齋，魏明鏡，等.現(xiàn)代臨床生化檢驗(yàn)學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社，2001:1179-1184.

[4]何雅軍，馬福廣，楊少華.2000例全自動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)血紅蛋白異常結(jié)果分析[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2004，12(2):24-25.

[5]張春榮.全自動(dòng)蛋白電泳系統(tǒng)在篩查β地中海貧血1913例中的應(yīng)用[J].廣西醫(yī)學(xué)，2008，30(12):1866-1867.

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