中和確認(rèn)試驗(yàn)在電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)乙型肝炎表面抗原弱反應(yīng)性中的價(jià)值探討

胡 堯，劉維薇，黃志基

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040)

乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是乙型肝炎診斷及治療評(píng)估的重要血清學(xué)標(biāo)志物。在我國的乙型肝炎病毒(HBV)感染人群中，有一部分血清HBsAg呈低水平狀態(tài)存在，用傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)，這部分患者往往會(huì)被漏檢。隨著微粒子酶免疫熒光法(micropartical enzyme immunofluorescence assay，MEIA)和電化學(xué)發(fā)光免疫法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)代替 ELISA，HBsAg檢測(cè)的敏感性和特異性得到顯著提高，特別是對(duì)攜帶弱反應(yīng)性HBsAg人群的檢出率明顯提高。但在檢測(cè)敏感性提高的同時(shí)，這些弱反應(yīng)性HBsAg檢出存在著假陽性，需要對(duì)部分HBsAg弱反應(yīng)性結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。為此，我們對(duì)采用ECLIA檢測(cè)弱反應(yīng)性HBsAg的血清標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)，并對(duì)確認(rèn)結(jié)果進(jìn)行分析和討論。

材料和方法

一、研究對(duì)象

2010年6月至2011年2月采用羅氏MODULAR ANALYTICS E-170全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)華山醫(yī)院門診及住院患者HBV血清標(biāo)志物，其中弱反應(yīng)性 HBsAg(1.0 ＜COI＜50.0)100例，男63例，女37例，年齡21～89歲。

二、儀器和試劑

1.儀器 MODULAR ANALYTICS E-170全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，瑞士羅氏公司。

2.試劑 HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒包括HBsAg及其抗體(抗HBs)、HBV e抗原(HBeAg)及其抗體(抗 HBe)、HBV核心抗體(抗 HBc)，HBsAg確認(rèn)試驗(yàn)試劑盒以及HBsAg校準(zhǔn)品[溯源至世界衛(wèi)生組織(WHO)HBsAg國際標(biāo)準(zhǔn)品，亞型adw 2.00/558]，瑞士羅氏公司。室內(nèi)質(zhì)控，Hepatitis and Retrovirus，美國伯樂公司。

三、方法

1.HBV血清標(biāo)志物、定標(biāo)品、室內(nèi)質(zhì)控品的檢測(cè) 采用ECLIA，按照羅氏E-170全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的操作規(guī)程進(jìn)行，所測(cè)結(jié)果均由儀器自動(dòng)完成。HBsAg＞1.0COI時(shí)判為陽性，所有結(jié)果均經(jīng)過復(fù)檢。

2.HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn) 操作嚴(yán)格按照羅氏E-170儀器的操作規(guī)程進(jìn)行。所有標(biāo)本均經(jīng)13000×g離心10 min。在標(biāo)本中加入特異性針對(duì)HBsAg的人型中和抗體(確認(rèn)試劑)，如果血清中存在HBsAg，則會(huì)被特異性的抗體中和。同時(shí)測(cè)定同一標(biāo)本加入中和抗體(確認(rèn)試劑)與未加入中和抗體(對(duì)照試劑)的COI值，分別用COI(確認(rèn))和COI(對(duì)照)表示，計(jì)算X=COI(確認(rèn))/COI(對(duì)照)×100。結(jié)果判斷見表1。

表1 確認(rèn)試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、100份弱反應(yīng)性HBsAg標(biāo)本的確認(rèn)試驗(yàn)

10例陰性結(jié)果和3例不確定標(biāo)本的COI值在1.01 ～1.97 之間，結(jié)果見表2。

二、弱反應(yīng)性HBsAg確認(rèn)結(jié)果的ROC曲線分析

采用SPSS 11.5軟件對(duì)弱反應(yīng)性HBsAg確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行ROC曲線分析，曲線下面積為0.945±0.0215，當(dāng)ECLIA 檢測(cè)HBsAg的 COI值為1.97 時(shí)，特異性可達(dá)100.0%，敏感性為83.9%。見圖1。

三、不同乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物模式標(biāo)本低水平HBsAg確認(rèn)結(jié)果

HBsAg陽性設(shè)定為1，抗HBs陽性設(shè)定為2，HBeAg陽性設(shè)定為3，抗 HBe陽性設(shè)定為4，抗HBc陽性設(shè)定為5，結(jié)果見表3。

表2 100份HBsAg標(biāo)本確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果[例(%)]

圖1 弱反應(yīng)性HBsAg確認(rèn)結(jié)果的ROC曲線

表3 不同乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物模式標(biāo)本HBsAg確認(rèn)結(jié)果

討 論

血清HBsAg的弱反應(yīng)性存在可能與HBV感染患者年齡增長，HBV的整合、清除、變異，血清學(xué)轉(zhuǎn)換，出現(xiàn)抗HBs以及含HBV循環(huán)免疫復(fù)合物的形成等有關(guān)，并與來自宿主方面的諸多因素有關(guān)[1-2]。因此準(zhǔn)確檢測(cè)并報(bào)告低水平的HBsAg具有重要的流行病學(xué)和臨床意義[3]。

然而HBsAg檢測(cè)結(jié)果呈弱反應(yīng)性可能是假陽性結(jié)果[4]。引起HBsAg假陽性有多種原因，目前認(rèn)為主要分3類:第1類是由于標(biāo)本分析前和分析中處理不當(dāng)，主要是隨機(jī)誤差引起的，如血液標(biāo)本的凝集不完全等所致[5]，可通過同一標(biāo)本復(fù)檢排除。我們收集的100例標(biāo)本，均經(jīng)高速離心復(fù)檢，剔除可能存在的第1類假陽性的標(biāo)本。第2類是同一標(biāo)本復(fù)檢不能排除，必須進(jìn)行特異抗體中和試驗(yàn)才能排除，可能存在某些非特異性干擾物質(zhì)[6]。國內(nèi)文獻(xiàn)對(duì) ELISA[7]、MEIA[8-9]等方法檢測(cè)低水平HBsAg的確認(rèn)試驗(yàn)報(bào)道較多，但對(duì)ECLIA方法相對(duì)報(bào)道較少。我們對(duì)100例HBsAg檢測(cè)結(jié)果COI值在1.00～50.0的血清標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，確認(rèn)結(jié)果陽性率為87.0%，陰性率為10.0%，還有3例為不確定結(jié)果;10例陰性結(jié)果和3例不確定標(biāo)本的COI值在1.01～1.97之間;而當(dāng)COI值＞1.97時(shí)，確認(rèn)結(jié)果的符合率達(dá)到100.0%(79/79)，因此ECLIA對(duì)弱反應(yīng)性HBsAg檢測(cè)不僅敏感性高，而且具有較高的特異性。ROC曲線分析結(jié)果顯示，當(dāng)ECLIA檢測(cè)HBsAg的COI為1.97時(shí)，特異性可達(dá)100.0%，敏感性為83.9%。我們認(rèn)為采用ECLIA系統(tǒng)檢測(cè)HB-sAg出現(xiàn)弱反應(yīng)性結(jié)果時(shí)，當(dāng)COI值＞2.00，基本可以排除假陽性的可能，無需再做確認(rèn)試驗(yàn);而當(dāng)1.00＜COI＜2.00時(shí)，建議對(duì)這部分被檢者進(jìn)行復(fù)檢和隨訪，如有可能最好進(jìn)一步做確認(rèn)試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。由于本研究標(biāo)本數(shù)量有限，尚需大量試驗(yàn)證實(shí)。第3類是中和確認(rèn)試驗(yàn)也不能排除，本次研究有3例確認(rèn)結(jié)果為不確定。究其原因各類文獻(xiàn)都有報(bào)道，如HBV疫苗接種后，但此類干擾持續(xù)時(shí)間較短[10]。因此，對(duì)患者進(jìn)行短期隨訪，對(duì)于HBsAg的確認(rèn)具有重要價(jià)值。

本研究還發(fā)現(xiàn)，弱反應(yīng)性HBsAg標(biāo)本中約有80%的患者處于乙型肝炎“小三陽”狀態(tài)。主要原因是，病程在轉(zhuǎn)換過程中HBsAg含量較低;約有7%的患者存在抗HBs同時(shí)陽性，可能存在HBsAg/抗HBs的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。乙型肝炎血清標(biāo)志物僅HBsAg陽性4例，經(jīng)確認(rèn)試驗(yàn)為陰性，可能存在干擾物質(zhì)。3例不確定的標(biāo)本，HBV血清標(biāo)志物抗HBe、抗HBc呈陽性，需要進(jìn)一步隨訪。

美國病理學(xué)家協(xié)會(huì)(College of American Pathologists，CAP)在其能力驗(yàn)證(proficiency testing，PT)中要求對(duì)弱反應(yīng)性HBsAg結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。中和確認(rèn)試驗(yàn)對(duì)于ECLIA檢測(cè)的弱反應(yīng)性HBsAg結(jié)果的確認(rèn)是一種特異性和敏感性較高的方法。

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