關(guān)于免疫透射比濁法測定波長選擇的探討

董曉妮，張文灝

(涿州市中醫(yī)院，河北 涿州 072750)

近年來隨著大型全自動生化分析儀的普及以及免疫診斷的發(fā)展，免疫透射比濁法檢測項目不斷增加，正確理解和設(shè)置生化分析儀參數(shù)對提高分析敏感性和特異性以及保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有重要的指導(dǎo)作用。采用免疫透射比濁法原理測定的項目參數(shù)設(shè)置具有一定的特殊性，我們僅就測定波長的選擇進(jìn)行了探討。

一、免疫透射比濁法的檢測原理

免疫透射比濁法的檢測原理近似符合雷利(Rayleigh)散射定律:

其中λ為入射光波長;I0為入射光強(qiáng)度;Iθ為與入射光成θ角處散射光強(qiáng)度;v為單個粒子尺寸;n為粒子對一定波長光的折射率;n0為粒子存在的溶劑(基質(zhì))對一定波長光的折射率;θ為光信號檢測器與入射光的夾角;γ為單位容積內(nèi)粒子的數(shù)目，即待測物濃度[1]。

在生化儀反應(yīng)體系中 λ、I0、Iθ、n、n0、θ 為常量;γ即抗原(Ag)-抗體(Ab)復(fù)合物濃度，為自變量，其大小可通過測定反應(yīng)體系中的吸光度(A)值來確定。

免疫透射比濁法中Ag與Ab的結(jié)合反應(yīng)為:Ag+Ab→Ag-Ab，反應(yīng)所形成的Ag-Ab復(fù)合物在反應(yīng)液中是不溶的懸浮顆粒，當(dāng)光束通過Ag-Ab復(fù)合物時發(fā)生散射、吸收、折射、反射等一系列光學(xué)變化。各種光學(xué)作用的大小主要取決于入射光強(qiáng)度、波長、顆粒大小、質(zhì)地形狀及Ag-Ab復(fù)合物的濃度[2]。

影響檢測敏感性和特異性的主要因素有以下2個方面:(1)反應(yīng)體系中Ag-Ab復(fù)合物的濃度和特性;Ab特異性高、親和力強(qiáng)，反應(yīng)的特異性強(qiáng);(2)反應(yīng)體系的基質(zhì)會影響光散射。

二、測定波長選擇與分析敏感性和特異性的關(guān)系

在實(shí)際反應(yīng)中Ag-Ab復(fù)合顆粒大小隨著反應(yīng)進(jìn)行，與波長比例逐漸加大，透射光所占比例逐漸減小，同時粒子折光率也發(fā)生變化。為探討波長與反應(yīng)進(jìn)程之間的關(guān)系，我們使用首都醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)科技中心生產(chǎn)的載脂蛋白A1試劑，在全自動生化儀上選取8個波段進(jìn)行校準(zhǔn)測定，讀取反應(yīng)A值，測定結(jié)果見表1。

表1 不同波長時測定校準(zhǔn)品的A值

以上數(shù)據(jù)表明，不同的入射光波長可以產(chǎn)生相當(dāng)?shù)奈馓荻?，隨著波長的加大A值降低，根據(jù)雷利公式，免疫透射比濁法不同于化學(xué)反應(yīng)有特異的吸收波峰，在每個波長都有相應(yīng)的A值變化。

三、雙波長分析主、副波長在免疫比濁法中的應(yīng)用原則

在生化儀設(shè)定中 ΔA=A主波長－A副波長，一般做以下考慮:取吸收峰對應(yīng)的波長為主波長，吸收光譜曲線的“波谷”對應(yīng)的波長為副波長。見圖1。

圖1 免疫比濁法中的主、副波長選擇模式示意圖

反應(yīng)中顯色產(chǎn)物的吸收峰對應(yīng)的波長為主波長，而試劑空白(顯色劑)的吸收峰對應(yīng)的波長為副波長。這樣在反應(yīng)液中待測物濃度越大，剩余的顯色劑量越小，使主、副波長的A值差距拉大，ΔA增大，提高了檢測敏感性。

免疫透射比濁法中 A主波長與 A副波長變化方向相同，使用A主波長－A副波長反而減小了A值變化，降低了敏感性，所以在免疫透射比濁法中不建議使用副波長。

四、總結(jié)

根據(jù)免疫透射比濁法的測定原理，在分子測定波長對免疫透射比濁法分析敏感性和特異性影響的基礎(chǔ)上，提出以下幾點(diǎn)波長選擇的原則:(1)合適的波長區(qū)間。根據(jù)表1血清中常見的內(nèi)源性大分子物質(zhì)及其相對分子質(zhì)量、直徑選擇合適的測定波段。由于干擾物乳糜(CM)在體內(nèi)半壽期為5～20 min，正常人空腹血中不含CM顆粒，但高脂蛋白血癥Ⅰ型和V型患者空腹血清含有CM顆粒，在CM水解期出現(xiàn)CM顆粒，此時會出現(xiàn)肉眼可見的CM血，同時會干擾生化儀的測定，所以要盡可能選擇對CM樣本有抗干擾能力的試劑;(2)降低波長可提高分析敏感性，增大波長可提高抗干擾能力;(3)可以不使用副波長。

[1]沈 霞.臨床免疫學(xué)與免疫學(xué)檢驗(yàn)新技術(shù)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社，2002:22-35.

[2]張惠中.臨床生物化學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:478-479.