質(zhì)粒介導(dǎo)aac(6')-Ib基因檢測(cè)與喹諾酮類耐藥

趙 倩， 汪雅萍，應(yīng)春妹， 鄭 冰，張灝旻， 楊 俊

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200127)

大腸埃希菌是我國(guó)泌尿生殖系感染最為常見(jiàn)的病原菌[1]，臨床治療常選喹諾酮類抗菌藥物[2]，在抗菌藥物選擇壓力下，大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物耐藥率逐年升高。喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制復(fù)雜，主要由靶位改變和主動(dòng)外排兩個(gè)機(jī)制所致，這兩者均由染色體突變引起[3-4]。21世紀(jì)初期質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥(PMQR)機(jī)制被關(guān)注，其中喹諾酮類修飾酶基因aac(6')-Ib基因變異體(cr)可引起低水平的PMQR[5]。由于質(zhì)粒具有接合、轉(zhuǎn)移等多種特性，以此為載體可引起水平傳播的耐藥基因給人類帶來(lái)很大危害，因此，研究?jī)r(jià)值重大。本實(shí)驗(yàn)了解上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物耐藥情況并分析質(zhì)粒介導(dǎo)aac(6')-Ib基因存在與喹諾酮類藥物耐藥性的關(guān)系。

材料和方法

一、材料

1.菌株來(lái)源 收集上海仁濟(jì)醫(yī)院2010年3月至2011年3月臨床中段尿分離大腸埃希菌121株，其中環(huán)丙沙星敏感株27株，耐藥株94株;質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

2.培養(yǎng)基 血平板為上海伊華生物科技有限公司產(chǎn)品。MH平板為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。

3.抗菌藥物紙片 阿米卡星、慶大霉素、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢美唑、哌拉西林-他唑巴坦、亞胺培南、美洛培南、厄他培南、萘啶酸、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲口惡唑?yàn)橛?guó)OXOID公司產(chǎn)品。

4.試劑及儀器 離心柱型-質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳相關(guān)試劑均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。PCR引物購(gòu)于上海英濰捷基貿(mào)易有限公司，aac(6')-Ib基因引物序列參照文獻(xiàn)[5]，見(jiàn)表1。Phoenix-100全自動(dòng)微生物鑒定儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)為上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

表1 aac(6')-Ib基因的PCR引物序列

二、方法

1.菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) Phoenix-100全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏系統(tǒng):按儀器說(shuō)明書(shū)操作。所有菌株均嚴(yán)格按2009年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的紙片擴(kuò)散法(K-B)對(duì)21種抗菌藥物的耐藥性檢測(cè)并判讀結(jié)果。

2.基因組DNA制備 離心柱型-質(zhì)粒小提試劑盒(編號(hào):DP103-02)按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。

3.PCR擴(kuò)增 總反應(yīng)體系為50 μL，其中10× PCR 緩沖液 (25mM)5 μL，dNTP(10mM)4 μL，上游引物(50pM)和下游引物(50pM)各2 μL，DNA 模板 4 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.3 μL，Sterial dd H2O 32.7 μL。aac(6')-Ib 基因PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件:94℃ 5 min預(yù)變性;循環(huán)變性94 ℃ 30 s，復(fù)性55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。

4.瓊脂糖凝膠電泳 取10 μL PCR產(chǎn)物混合2 μL溴酚藍(lán)，1.2%的瓊脂糖凝膠(含溴乙錠)電泳，電壓恒定為150V，30 min，在紫外燈下觀察結(jié)果。如果出現(xiàn)明顯的482bp亮帶即為aac(6')-Ib基因陽(yáng)性。

5.DNA測(cè)序并確定基因型 將所有 aac(6')-Ib基因陽(yáng)性株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。DNA序列利用 NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blastn程序進(jìn)行比對(duì)確定基因型。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用WHONET5.4軟件及 SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、121株大腸埃希菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果

121株大腸埃希菌臨床分離株對(duì)厄他培南、亞胺培南、美洛培南3種碳青霉烯類抗菌藥物未產(chǎn)生耐藥;對(duì)頭孢美唑、哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星耐藥率較低，分別為3.3%、14.0%和16.7%;對(duì)其他抗菌藥物耐藥率均高(＞55%);對(duì)4種喹諾酮類抗菌藥物耐藥率均高于75.0%，特別是第一代藥物萘啶酸耐藥率為91.7%，且只要菌株對(duì)喹諾酮類抗菌藥物耐藥抑菌圈皆為6 mm。對(duì)左氧氟沙星敏感率為17.4%明顯高于環(huán)丙沙星為9.9%，略高于諾氟沙星為14.9%，這可能與環(huán)丙沙星作為喹諾酮類代表性藥物更常被臨床應(yīng)用以及左氧氟沙星具有優(yōu)越的體外抗菌活性有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[6]。

二、大腸埃希菌aac(6')-Ib基因陽(yáng)性與陰性菌株的耐藥性比較結(jié)果

大腸埃希菌aac(6')-Ib陽(yáng)性與陰性菌株的耐藥性比較結(jié)果見(jiàn)表2。環(huán)丙沙星敏感株中未檢測(cè)aac(6')-Ib基因。

表2 大腸埃希菌aac(6')-Ib基因陽(yáng)性與基因陰性菌株的耐藥性比較 (%)

三、aac(6')-Ib基因PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

121株大腸埃希菌中17株擴(kuò)增出482bp aac(6')-Ib片段，陽(yáng)性率為14.0%(17/121)。部分菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶見(jiàn)圖1。瓊脂糖凝膠電泳均呈單一條帶，且與目的片段大小相符。對(duì)所有17株aac(6')-Ib陽(yáng)性菌株擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果14株在aac(6')-Ib的第223位均出現(xiàn)點(diǎn)突變T→A，即攜帶aac(6')-Ib-cr[Trp→Arg(色氨酸→精氨酸)]，突變率為 82.4%(14/17)，經(jīng)與 NCBI Genebank中aac(6')-Ib-cr基因變異體(cr)比對(duì)吻合率為99%(注冊(cè)號(hào):FJ949571.1);3株菌未發(fā)生突變，DNA序列與Genbank中的aac(6')-Ib基因(注冊(cè)號(hào):HM569733.1)比對(duì)吻合率為99%。

圖1 部分菌株aac(6')-Ib基因PCR電泳結(jié)果

討 論

喹諾酮類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制復(fù)雜，1998年以前人們一直認(rèn)為喹諾酮類耐藥是由細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶基因或/和調(diào)節(jié)外排泵表達(dá)的基因發(fā)生染色體突變所致[7-8]。近年來(lái)質(zhì)粒介導(dǎo)PMQR機(jī)制備受關(guān)注，qnr基因和aac(6')-Ib基因cr等相繼被發(fā)現(xiàn)。朱東安等[9]發(fā)現(xiàn)1株同時(shí)具有質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因qnr S和CTX-M-3型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的福氏志賀菌。汪雅萍等[10]報(bào)道志賀菌若攜帶qnr基因可使喹諾酮類抗菌藥物的敏感性降低。Robicsek等[11]報(bào)道aac(6')-Ib基因cr是氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶變異體基因，能修飾滅活氨基糖苷類和喹諾酮類2大類化學(xué)母體結(jié)構(gòu)各異藥物，并且能提高暴露于環(huán)丙沙星的菌株發(fā)生染色體突變的幾率。研究表明，aac(6')-Ib基因cr于223位、454位發(fā)生2個(gè)堿基突變可致表達(dá)蛋白2處氨基酸位點(diǎn)改變，最終蛋白產(chǎn)物為一類氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶，該類酶通過(guò)對(duì)含哌嗪胺為底物的喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星及諾氟沙星脫乙?；饔弥率顾幬锩舾行越档?。aac(6')-Ib基因cr在太平洋地區(qū)大腸埃希菌中檢出率最高[5]。

本研究中，aac(6')-Ib基因檢出17株，大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物敏感菌株中未檢測(cè)出aac(6')-Ib基因。對(duì)17株aac(6')-Ib基因陽(yáng)性株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，其中14株為 aac(6')-Ib基因cr，其余3株未發(fā)生突變。突變株與未突變株對(duì)21種抗菌藥物的耐藥率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，可能檢出菌株偏少影響統(tǒng)計(jì)。我們對(duì)大腸埃希菌aac(6')-Ib基因陽(yáng)性與陰性菌株的耐藥性進(jìn)行比較可見(jiàn)陽(yáng)性株對(duì)阿米卡星耐藥率高于陰性株且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);未見(jiàn)慶大霉素的差異與文獻(xiàn)報(bào)道稍有不同[5]，可能與質(zhì)粒介導(dǎo)低水平耐藥有關(guān);但我們的研究可見(jiàn)在β-內(nèi)酰胺酶抑制劑藥物(氨芐西林-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦)和頭孢菌素類藥物(頭孢唑啉、頭孢克洛和頭孢呋辛)間陽(yáng)性株耐藥率高于陰性株且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);特別是以易遭aac(6')-Ib變異體酶乙酰化的哌嗪胺為底物的氟喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星和諾氟沙星)間存在陽(yáng)性株耐藥率高于陰性株且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)[8];至于左氧氟沙星的差異可能與aac(6')-Ib基因cr存在會(huì)大大增加環(huán)丙沙星染色體選擇突變有關(guān)[5]，染色體突變的同時(shí)也引起左氧氟沙星耐藥，這有待于進(jìn)一步研究。

另外，我們已知aac(6')-Ib基因cr可同時(shí)導(dǎo)致氨基糖甙類和喹諾酮類兩種藥物失活，而且還能提高暴露于環(huán)丙沙星的菌株發(fā)生染色體突變的幾率，由本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可見(jiàn):大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物耐藥菌株抑菌圈皆為6mm是高水平耐藥，更似染色體基因已發(fā)生突變?cè)斐傻哪退帲@種推測(cè)有待進(jìn)一步證實(shí)。

質(zhì)粒介導(dǎo) aac(6')-Ib基因 cr通過(guò)參與PMQR機(jī)制僅介導(dǎo)低水平的喹諾酮耐藥，但其給臨床帶來(lái)的危害嚴(yán)重。其一，PMQR機(jī)制易在喹諾酮藥物的選擇壓力下選擇出染色體突變株，引起更高水平的喹諾酮類耐藥產(chǎn)生。其二，aac(6')-Ib基因cr依借質(zhì)粒載體可引起多宿主間的廣泛傳播。其三，質(zhì)粒通常具有捕捉耐藥基因的特性，易造成菌株的多重耐藥性。盡管aac(6')-Ib基因cr于21世紀(jì)才被關(guān)注，但在中國(guó)上海自2000年至2001年間其就已經(jīng)存在于過(guò)半的多重耐藥大腸埃希菌分離株中[5]。因此，廣大醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)重視細(xì)菌的耐藥問(wèn)題，合理使用抗菌藥物，為及時(shí)有效預(yù)防和控制院內(nèi)感染發(fā)生，減少多重耐藥細(xì)菌產(chǎn)生出一份力。

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