血流感染患者金黃色葡萄球菌erm基因檢測及流行病學(xué)研究

王立新，胡祎明，胡志東，田 彬，李 靜，王鳳霞，楊 華

(1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，天津 300052;2.天津醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，天津 300203)

金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院和社區(qū)感染的主要病原體，其感染有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。金黃色葡萄球菌可以引起多種感染，由其引起的血流感染由于發(fā)生率高、預(yù)后差而備受關(guān)注。對多耐藥株，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的感染已成為抗感染治療中的一個(gè)難題。MRSA可同時(shí)對β-內(nèi)酰胺類、酶抑制劑復(fù)合抗菌藥物及碳青霉烯類藥物耐藥，因此臨床醫(yī)生在治療由其引起的感染時(shí)常使用大環(huán)內(nèi)酯類(macrolide)、林可酰胺類(lincosamide)和B類鏈陽霉素類(streptogramin type B)奎奴普丁[2]，但目前的研究顯示引起血流感染的金黃色葡萄球菌已對紅霉素、克林霉素有較高的耐藥率[3]。本研究對2006至2011年臨床分離的39株引起血流感染的紅霉素耐藥金黃色葡萄球菌進(jìn)行紅霉素核糖體甲基化酶(erm)基因檢測，并進(jìn)行同源性分析，以了解耐藥基因的分布及其流行情況。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源 收集2006年1月至2011年8月自臨床分離的39株引起血流感染的紅霉素耐藥金黃色葡萄球菌，剔除同一患者重復(fù)分離菌株，標(biāo)本主要來源于感染科、腎科、重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)、血液科等臨床科室。全部菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)。

2.試劑與儀器 VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)，9700型基因擴(kuò)增儀(美國 Perkin Elmer公司)，電泳儀(北京市六一儀器廠)，凝膠成像儀、CHEFⅢ型脈沖電泳儀(美國 Bio-Rad公司)，紅霉素(15 μg)、克林霉素(2 μg)紙片和其他藥物敏感性紙片(北京天壇公司)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑、DNA Maker和限制性內(nèi)切酶SmaI[寶生物工程(大連)有限公司]，溶葡萄球菌素(意大利BBI公司)。

二、方法

1.細(xì)菌鑒定及藥物敏感性試驗(yàn) 應(yīng)用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀及配套鑒定卡、藥物敏感性卡對細(xì)菌進(jìn)行鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)指南(2010年版)[4]進(jìn)行。頭孢西丁紙片擴(kuò)散法篩選MRSA。

2.D試驗(yàn)測定紅霉素對克林霉素的誘導(dǎo)耐藥表型 D試驗(yàn)操作按CLSI指南(2010年版)[4]進(jìn)行。

3.erm基因的檢測 煮沸法制備DNA模板，25 μL反應(yīng)體系，引物序列和PCR反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[5]，見表1。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，主要PCR陽性產(chǎn)物測序結(jié)果與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

表1 用于erm基因檢測的引物序列及反應(yīng)條件

4.脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型 參考Goering等[6]PFGE方法，略加改動(dòng)。制備完成的小膠經(jīng)30 U限制性內(nèi)切酶Sma I在30℃ 酶切4 h后放入電泳槽，電泳溫度14℃，電泳時(shí)間18 h，電泳方向角度變換120°，電壓6 V/cm，線性梯度變化4 ～40 s。電泳結(jié)束后，將膠放入含 0.5 μg/mL 的溴化乙啶(EB)中染色30～40 min，放入凝膠成像系統(tǒng)成像。結(jié)果判讀按美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)Tenover等[7]推薦的方法判讀:圖譜完全相同的定義為一個(gè)型;彼此之間相差1個(gè)條帶的定義為同一型的不同亞型;相差2～3個(gè)條帶的認(rèn)為親緣關(guān)系密切;相差4～6個(gè)條帶的認(rèn)為可能相關(guān);條帶相差7個(gè)以上的則認(rèn)為無親緣關(guān)系。隨機(jī)選擇不同字母，如A、B、C、D等的字母順序分型。

5.葡萄球菌染色體mec(SCCmec)分型 按Zhang等[8]介紹的多重PCR進(jìn)行SCCmec分型。反應(yīng)體系為25 μL，共9對引物。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性45 s，65℃退火45 s，72℃延伸90 s，10個(gè)循環(huán)，隨后94℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)25次，最后72℃延伸10 min。電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)觀察。

結(jié) 果

一、D試驗(yàn)測定誘導(dǎo)耐藥表型結(jié)果及MRSA篩選結(jié)果

39株紅霉素耐藥金黃色葡萄球菌中有8株為紅霉素耐藥而克林霉素敏感，D試驗(yàn)全部為陽性，為誘導(dǎo)性耐藥，陽性率20.5%。31株為結(jié)構(gòu)性耐藥，見圖1。10株金黃色葡萄球菌對頭孢西丁的抑菌圈直徑≤21 mm，判定為MRSA。

圖1 紅霉素對克林霉素的誘導(dǎo)性耐藥及結(jié)構(gòu)性耐藥

二、erm基因檢測結(jié)果

39株紅霉素耐藥金黃色葡萄球菌中erm基因的攜帶率為100.00%，檢出 ermA基因10株(25.6%)、ermB 基因 18 株(46.2%)、ermC 基因18株(46.2%)，其中同時(shí)攜帶ermA和ermC基因7株(17.9%)。紅霉素對克林霉素誘導(dǎo)耐藥株ermC基因攜帶率為75.0%(6/8)，ermA基因攜帶率為25.0%(2/8)。主要PCR產(chǎn)物部分測序結(jié)果經(jīng)GenBank比對證實(shí)，ermA、ermB、ermC(登錄號依次為:AF466413、HQ683763、Y09002)同源性均為99%。電泳結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 ermA基因電泳圖

圖3 ermB、ermC基因電泳圖

三、erm基因在不同菌株中的分布

erm基因在MRSA、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)中及在結(jié)構(gòu)性耐藥株和誘導(dǎo)性耐藥株中的分布見表2。

表2 erm基因在不同菌株中的分布

四、藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

39株紅霉素耐藥金黃色葡萄球菌對克林霉素、青霉素、慶大霉素的耐藥率高，分別為100.0%、92.3%、53.8%，攜帶 ermA/A+C、ermB和單獨(dú)攜帶ermC株的耐藥率見表3。

表3 攜帶不同erm基因的金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥率 (%)

五、PFGE分型結(jié)果

10株攜帶ermA基因的MRSA共分為6型，分別為A型 (2株)、B型 (1株)、C型 (2株)、D型 (1株)、E型 (2株)、F型 (2株)。見圖4。

圖4 ermA基因陽性株的PFGE圖譜

六、SCCmec分型結(jié)果

10株攜帶ermA基因的MRSA中，8株為SCCmecⅢ型，2株未能分型。見圖5。

圖5 SCCmec分型電泳圖

討 論

金黃色葡萄球菌是臨床常見的病原菌。目前臨床分離自血流感染的金黃色葡萄球菌對紅霉素和克林霉素的耐藥率均 ＞50.0%[3]。金黃色葡萄球菌對大環(huán)內(nèi)酯類如紅霉素、林可酰胺類如克林霉素和B類鏈陽霉素類抗菌藥物的耐藥機(jī)制有能量依賴的主動(dòng)泵出和核糖體靶位改變2種。前者由msrA、msrB基因編碼，對大環(huán)內(nèi)酯及鏈陽霉素類耐藥，后者與erm基因相關(guān)，由erm基因編碼產(chǎn)生的erm導(dǎo)致23S rRNA的甲基化作用，降低了大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和B類鏈陽霉素抗菌藥物對核糖體的結(jié)合從而產(chǎn)生耐藥。由erm基因介導(dǎo)的耐藥可以是誘導(dǎo)型和結(jié)構(gòu)型2種。誘導(dǎo)型通常的耐藥表型是紅霉素耐藥但克林霉素敏感，必須進(jìn)行D試驗(yàn)才能檢測出來[9]，結(jié)構(gòu)型通常的耐藥表型是紅霉素和克林霉素均耐藥[2]。

本研究結(jié)果顯示，39株分離自血流感染患者的紅霉素耐藥金黃色葡萄球菌全部攜帶erm基因。攜帶ermA基因的菌株均為MRSA，多表現(xiàn)為多藥耐藥，單獨(dú)攜帶ermA和同時(shí)攜帶ermA、ermC的金黃色葡萄球菌對多種藥物的耐藥率明顯高于攜帶ermB和單獨(dú)攜帶ermC的菌株。攜帶ermB基因的菌株全部為MSSA(62.1%，18/29)，同時(shí)ermB基因也是引起分離自血流感染金黃色葡萄球菌結(jié)構(gòu)性耐藥的主要基因(58.1%，18/31)，本研究中ermB的檢出率明顯高于先前的研究[2，10]，可能存在地區(qū)性差異，也可能與標(biāo)本來源有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。8株紅霉素對克林霉素誘導(dǎo)耐藥株中6株攜帶ermC基因(75.0%，6/8)，2株攜帶ermA基因(25.0%，2/8)，未檢出 ermB 基因，本結(jié)果與沈定霞等[2]的研究結(jié)果一致，表明ermC基因是引起誘導(dǎo)性耐藥的主要機(jī)制。

SCCmec分型顯示10株攜帶ermA基因的MRSA其中8株為SCCmecⅢ型(2株未能分型)，表明引起血流感染的紅霉素耐藥的MRSA主要為SCCmecⅢ型。這與陳榮等[11]的研究結(jié)果一致。PFGE分型結(jié)果顯示10株MRSA共分為6型，部分菌株具有高度的同源性，同時(shí)某些型別之間親緣關(guān)系密切，此類菌株分布于同一病房或不同病房，提示攜帶ermA基因的金黃色葡萄球菌引起的醫(yī)院感染存在病房內(nèi)部和病房之間的散發(fā)克隆傳播。

本研究結(jié)果表明，erm基因在引起血流感染的紅霉素耐藥金黃色葡萄球菌中分布廣泛，是引起大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和B類鏈陽霉素抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制，同時(shí)由于MRSA均攜帶ermA基因，并存在散在克隆傳播現(xiàn)象，故應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)務(wù)人員生物安全觀念以及病區(qū)的消毒隔離意識，切斷病原菌傳播途徑，防止引起臨床感染的金黃色葡萄球菌在院內(nèi)引起進(jìn)一步傳播流行。

[1]Li DZ，Chen YS，Yang JP，et al.Preliminarymolecular epidemiology of the Staphylococcus aureus in lower respiratory tract infections:a multicenter study in China[J].Chin Med J(Engl)，2011，124(5):687-692.

[2]沈定霞，羅燕萍，徐雅萍，等.葡萄球菌對紅霉素和克林霉素的誘導(dǎo)耐藥性研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28(4):400-402.

[3]王 進(jìn)，梁 軍，肖永紅.2008年Mohnarin血流感染病原菌構(gòu)成及耐藥性[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20(16):2399-2404.

[4]Clinical and Laboratory Stan dards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].M100-S20，CLSI，2010.

[5]Lina G，Quaglia A，Reverdy ME，et al.Distribution of genes encoding resistance to macrolides，lincosamides，and streptogramins among Staphylococci[J].Antimicrob Agents Chemother，1999，43(5):1062-1066.

[6]Goering RV，Winters MA.Rapid method for epidemiological evaluation of gram-positive Cocci by field inversion gel electrophoresis[J].J Clin Microbiol，1992，30(3):577-580.

[7]Tenover FC，Arbeit RD，Goering RV，et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis:criteria for bacterial strain typing[J].J Clin Microbiol，1995，33(9):2233-2239.

[8]Zhang K，McClure JA，Elsayed S，et al.Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant sub typing of staphylococcal cassette chromosome mec typesⅠtoⅤin methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].J CIin Microbiol，2005，43(10):5026-5033.

[9]孫建文，萬新亮，任孔華，等.金黃色葡萄球菌對紅霉素和克林霉素誘導(dǎo)耐藥分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25(9):675-677.

[10]賈 偉，趙志軍，楊曉燕，等.葡萄球菌對克林霉素誘導(dǎo)耐藥表型及基因型檢測研究[J].分子診斷與治療雜志，2010，2(2):94-97.

[11]陳 榮，沈定霞，閆中強(qiáng)，等.47株金黃色葡萄球菌臨床血流感染分離株的基因分型研究[J].中華流行病學(xué)雜志，2010，31(3):312-315.