ITS片段作為輪枝菌DNA條形碼的評(píng)價(jià)研究

段維軍， 張慧麗， 郭立新， 顧建鋒， 陳先鋒， 張祥林， 夏侯陽(yáng)

（1.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局，寧波 315012；2.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，烏魯木齊 830063；3.寧波大學(xué)，寧波 315212）

植物病原性輪枝菌主要包括：黑白輪枝菌［Verticillium albo－atrum Reinke et Berthold（1879）］、大麗輪枝 菌 ［V.dahliae Klebahn （1913）］、三 體 輪 枝 菌［V.tricorpus Isaac（1953）］、變黑輪枝菌［V.nigrescens Pethybridge（1919）］、云狀輪枝菌［V.nubilum Pethybridge （1919）］、V.the obromae （Turconi）Mason et Hughes（1951）［1］以 及 長(zhǎng) 孢 輪 枝 孢 ［V.longisporum（Stark）Karapapa，Bainbr ＆ Heale（1997）］，也被稱為大麗輪枝菌長(zhǎng)孢變種［V.dahliae var.long is porum Stark（1961）］［2］。它們多能引起植物維管束病害，造成植物葉片黃化、落葉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物死亡。這些輪枝菌可產(chǎn)生多種休眠形態(tài)，如微菌核、厚垣孢子或休眠菌絲等，長(zhǎng)時(shí)間在土壤中存活。由于其嚴(yán)重危害性，其中的一些種類(lèi)，如大麗輪枝菌和黑白輪枝菌已經(jīng)被列為我國(guó)重要植物檢疫對(duì)象。這些輪枝菌均能夠產(chǎn)生典型的輪枝狀分生孢子梗，形態(tài)十分接近，單純依靠形態(tài)學(xué)特征很難加以準(zhǔn)確快速區(qū)分。

DNA條形碼技術(shù)（DNA Barcoding）是利用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)DNA片段對(duì)地球上現(xiàn)有物種進(jìn)行識(shí)別和鑒定的一項(xiàng)新技術(shù)［3］。自加拿大生物學(xué)家Hebert首先倡導(dǎo)將條形碼編碼技術(shù)應(yīng)用到比零售業(yè)更復(fù)雜的生物物種鑒定之后［4－5］，發(fā)展十分迅猛，是近年來(lái)進(jìn)展最迅速的學(xué)科前沿之一，在動(dòng)物、植物等多種生物上得到了廣泛重視。真菌的核糖體RNA基因簇同時(shí)存在于細(xì)胞核內(nèi)與線粒體中，由高度保守區(qū)和可變區(qū)組成，以其為代表的ITS基因標(biāo)記已被廣泛用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、預(yù)測(cè)種群結(jié)構(gòu)、評(píng)估種群進(jìn)化過(guò)程，生態(tài)學(xué)研究以及確定物種分類(lèi)地位等［6－11］，同時(shí)也被考慮作為DNA條形碼。但是，由于一些真菌類(lèi)群平均ITS片段小于有效進(jìn)行DNA編碼的最優(yōu)片段臨界值［12］，同時(shí)對(duì)于物種相對(duì)豐富的子囊菌類(lèi)群來(lái)說(shuō) ITS區(qū)段還存在變異性不足，難以有效區(qū)分不同種類(lèi)的缺點(diǎn)。因此，在適于作真菌DNA條形碼的基因區(qū)段的選擇上，還需做更多研究和評(píng)估工作。

本研究選擇ITS片段作為輪枝菌的候選DNA條形碼，對(duì)候選ITS片段的PCR擴(kuò)增和測(cè)序成功率、種內(nèi)與種間差異、種內(nèi)與種間距離的頻率分布進(jìn)行系統(tǒng)篩選和評(píng)價(jià)，以此來(lái)評(píng)估ITS片段作為輪枝菌條形碼的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株的分離、收集與純化

采用常規(guī)的組織塊PDA平板分離法及菌種收集工作，共得到植物病原性輪枝菌35株，分屬于13個(gè)種，進(jìn)行單孢分離后得到單孢分離株，保存在PDA試管斜面（4℃），備用。分離株編號(hào)、地理分布、寄主及來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 供試輪枝菌屬分離株Table 1 Isolates of Verticilliumspp.used in this study

續(xù)表1 Table1(Continued)

1.1.2 培養(yǎng)基

采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基進(jìn)行分離、純化、菌絲收集和保藏。

1.1.3 儀器和試劑

培養(yǎng)箱為德國(guó)MMM公司生產(chǎn)的Friocell 222型，核酸自動(dòng)化提取儀為美國(guó)ThermoFisher公司生產(chǎn)的Kingfisher型，PCR儀為Biometra公司生產(chǎn)的TProfessional Basic型，生物分光光度計(jì)為日本日立公司生產(chǎn)的U－0080D型，電泳設(shè)備和凝膠成像系統(tǒng)分別為伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的Power－Pac Basic型和GelDocEQ型；核酸提取試劑盒為臺(tái)灣奈米技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的TANBead Plant DNA Auto Kit型、Taq DNA聚合酶、MgCl2、10×PCR buffer、DL2000Marker、DNA片段純化試劑盒均購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；試驗(yàn)用引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

用滅菌槍頭刮取在PDA平板上培養(yǎng)20d左右菌株菌絲體，根據(jù)試劑盒及儀器使用說(shuō)明，在核酸自動(dòng)化提取儀上使用核酸提取試劑盒（臺(tái)灣奈米技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）進(jìn)行DNA提取。提取后DNA經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度后，凍存于－20℃冰箱備用。

1.2.2 基因的擴(kuò)增和測(cè)序

采用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增［16］。PCR擴(kuò)增在TProfessional Basic PCR儀上進(jìn)行，使用50μL體系。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳儀在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)擴(kuò)增成功后，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并用DNA片段純化試劑盒根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。將純化的PCR產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 ITS片段用于輪枝菌屬DNA條形碼的評(píng)價(jià)

1.2.3.1 獲得ITS片段的難易程度

不同基因序列獲得的難易程度用PCR擴(kuò)增與測(cè)序成功率表示，高質(zhì)量的測(cè)序圖譜，底峰較小，無(wú)雜峰、亂峰視為成功測(cè)序。PCR擴(kuò)增成功率和測(cè)序成功率的乘積為PCR擴(kuò)增與測(cè)序成功率。

1.2.3.2 ITS

利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序?qū)Λ@得的不同序列片段進(jìn)行比對(duì)分析，確認(rèn)序列的可靠性。將測(cè)得的序列與GenBank中下載的其他輪枝菌相關(guān)序列用CLUSTAL X［17］程序進(jìn)行分析，如果序列長(zhǎng)度不同，則只保留共有區(qū)段。將比對(duì)好的序列輸入DNAstar軟件（Lasergene，WI，USA）計(jì)算相似性矩陣，然后用Taxon－Gap軟件［18］分析各基因在種內(nèi)與種間的變異情況。

1.2.3.3 種內(nèi)與種間距離頻率分布

應(yīng)用Species identifier軟件［19］比較種內(nèi)及種間的遺傳距離差異，并用EXCEL軟件作圖分析。使用Species identifier的Best Match功能進(jìn)行條形碼種類(lèi)鑒定成功率的計(jì)算。

1.2.3.4 鄰接樹(shù)構(gòu)建

使用 MEGA5.0程序［20］進(jìn)行比對(duì)，以 NCBI上下載的大豆疫霉（Phytophthora sojae）的ITS序列（HQ643349）為外群，按照Saitou and Nei［21］的方法采用鄰接法（neighbor－joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行1000次重復(fù)抽樣計(jì)算系統(tǒng)樹(shù)中節(jié)點(diǎn)的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得序列的難易程度

評(píng)價(jià)DNA條形碼的一個(gè)重要指標(biāo)是序列獲得的難易程度，即PCR擴(kuò)增與測(cè)序的成功率。本研究成功獲得輪枝菌屬13個(gè)種35個(gè)菌株的ITS片段，片段長(zhǎng)度約為550bp左右，PCR擴(kuò)增與測(cè)序成功率為97.1%。

2.2 種內(nèi)與種間差異分析

本試驗(yàn)獲得的輪枝菌屬13個(gè)種35個(gè)ITS片段的序列，與GenBank下載的相關(guān)輪枝菌屬I(mǎi)TS序列共73條序列一起進(jìn)行分析，以探討ITS片段區(qū)分不同輪枝菌種類(lèi)的能力。輪枝菌屬I(mǎi)TS片段的種內(nèi)與種間序列差異分析如圖1所示，圖中黑色柱表示種間差異，白色柱表示種內(nèi)差異。結(jié)果表明，供試輪枝菌屬不同種類(lèi)中V.chlamydosporium、V.fungicola、V.griseum、V.lecanii、V.lindauianum、V.nigrescens、V.nubilum、V.psalliotae、V.theobromae和V.tricorpus的種間差異均大于種內(nèi)差異，占到了供 試 種 類(lèi) 的 76.9% （10／13），但 V.albo－atrum、V.dahliae和V.longisporum的種內(nèi)差異大于種間差異。

圖1 采用TaxonGap軟件分析輪枝菌屬I(mǎi)TS片段種內(nèi)與種間差異Fig.1 Comparisons of intra－and inter－specific variations of ITS fragment fromVerticilliumspp.

2.3 種內(nèi)與種間距離的頻率分布

應(yīng)用 Taxon DNA／Species identifier軟件Pairwise Summary功能對(duì)所獲得的各物種ITS序列進(jìn)行分析，ITS條形碼片段的種內(nèi)與種間距離的頻率分布如圖2所示。種內(nèi)距離（intraspecific distance）主要集中在0～5.0%間，而種間距離（interspecific distance）則在5%～40%之間，兩者存在交叉重疊，其中≤0的差異序列占42.6%。使用Species identifier的Best Match分析功能，能夠進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的序列占到了供試序列的94.5%（69／73）。

圖2 輪枝菌屬I(mǎi)TS序列種內(nèi)與種間差距的頻率分布Fig.2 Intraspecific and interspecific distances of ITS in Verticillium species

2.4 鄰接樹(shù)重建

輪枝菌屬I(mǎi)TS基因構(gòu)建的NJ樹(shù)顯示，同一個(gè)種的菌株聚在一起，不同的種則位于不同的末端分支，但是V.albo－atrum 和V.longisporum 不能很好分辨開(kāi)（圖3），這與ITS基因種內(nèi)與種間差異分析結(jié)果相一致。植物病原性輪枝菌，包括黑白輪枝菌、大麗輪枝菌、三體輪枝菌、變黑輪枝菌、云狀輪枝菌、V.the obromae和長(zhǎng)孢輪枝菌聚在了一起，形成了一個(gè)大的分支（bootstrap值為99）。其中的黑白輪枝菌、大麗輪枝菌、長(zhǎng)孢輪枝菌、三體輪枝菌和云狀輪枝菌具有更加緊密的親緣關(guān)系（bootstrap值為99）。非植物病原性輪枝菌聚為了另一個(gè)大的分支（bootstrap值為93）。

3 討論

輪枝菌屬真菌均可產(chǎn)生典型輪枝狀分生孢子梗，且存在較大的形態(tài)變異，一些賴以區(qū)分的典型形態(tài)結(jié)構(gòu)，如黑白輪枝菌的休眠菌絲，大麗輪枝菌的微菌核在培養(yǎng)中均有可能喪失，因此單純依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行輪枝菌種類(lèi)區(qū)分具有較高難度。與傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)方法比較，DNA條形碼的優(yōu)勢(shì)在于：（1）同一物種在其個(gè)體發(fā)育的各階段均能作為分析對(duì)象，增加了待檢樣本的采集渠道；（2）待檢對(duì)象不受其個(gè)體形態(tài)特征或組織特異性限制，樣品形態(tài)發(fā)生改變或者殘缺均不會(huì)影響識(shí)別結(jié)果；（3）識(shí)別速度快且準(zhǔn)確性高，克服因形態(tài)相似所導(dǎo)致的鑒定誤差，加速新物種的發(fā)現(xiàn)；（4）可操作性強(qiáng)，不需要專門(mén)的分類(lèi)學(xué)知識(shí)也可以完成物種的鑒定，節(jié)省人力和物力［22］。為了實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快捷而準(zhǔn)確的物種鑒定，DNA條形碼必須容易獲得，這是衡量DNA條形碼技術(shù)的最基本標(biāo)準(zhǔn)之一［23］。本研究表明，供試輪枝菌屬I(mǎi)TS片段很容易直接擴(kuò)增和測(cè)序，引物通用性強(qiáng)，擴(kuò)增測(cè)序成功率高達(dá)97.1%，具有合適的片段長(zhǎng)度（550bp左右），便于高通量測(cè)序與分析。同時(shí)，Genbank等DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中也已經(jīng)積累了大量真菌ITS序列，便于參照和比較分析。理想條形碼檢測(cè)到的同屬內(nèi)種間遺傳變異應(yīng)明顯大于種內(nèi)遺傳變異，并在兩者之間存在顯著差異，形成一個(gè)明顯的間隔區(qū)，它是評(píng)價(jià)DNA條形碼理想與否的另一個(gè)重要指標(biāo)［24－25］。本研究中，供試13個(gè)種中有10個(gè)種的種間差異大于種內(nèi)差異，存在交叉重疊，除無(wú)法成功區(qū)分親緣關(guān)系很近的種外，其序列鑒定成功率達(dá)94.5%。

圖3 根據(jù)輪枝菌ITS序列采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the neighbor－joining（NJ）analysis inferred from the ITS regions of Verticilliumspp.

近來(lái)研究表明，黑白輪枝菌和長(zhǎng)孢輪枝菌目前在種類(lèi)劃分上仍然存在較大爭(zhēng)議。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，來(lái)自于不同寄主和地理來(lái)源的黑白輪枝菌能夠被劃分為3個(gè)不同分支［26］。最近，Inderbitzin等已將黑白輪枝菌重新劃分為3個(gè)新種［27］。有研究表明長(zhǎng)孢輪枝孢可能是輪枝菌種間雜交所致，可能的親本來(lái)自于大麗輪枝菌、黑白輪枝菌或其他輪枝菌，其分生孢子中DNA含量接近大麗輪枝菌的1.75倍，由其所產(chǎn)生分生孢子長(zhǎng)度可達(dá)7～9μm，微菌核較大麗輪枝菌更加細(xì)長(zhǎng)［2，28］。Karapapa等認(rèn)為應(yīng)將歐洲油菜上分離的大麗輪枝菌長(zhǎng)孢變種上升到新種高度，即V.longisporum［28］。然而，也有一些與此不一致的報(bào)道。如來(lái)自于英國(guó)球芽甘藍(lán)（Brussels sprouts）的一株分離物具有較高的DNA含量，但是分生孢子卻較短［28］。分離物V33具有較長(zhǎng)分生孢子，但是DNA含量卻比較低［29］。本研究中ITS片段對(duì)黑白輪枝菌和長(zhǎng)孢輪枝菌劃分存在一定問(wèn)題可能與這些種類(lèi)分類(lèi)地位不穩(wěn)定存在一定關(guān)系，因此在對(duì)生物物種進(jìn)行DNA條形碼研究時(shí)，應(yīng)該選擇經(jīng)過(guò)可靠形態(tài)鑒定且不存在分類(lèi)爭(zhēng)議的物種為材料，然后測(cè)定其標(biāo)記基因的序列，以實(shí)現(xiàn)對(duì)該物種的有效DNA條形編碼。

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