牛乳樣品中布魯氏菌的分離和鑒定

易新萍，馬曉菁，閆晶華，谷文喜，劉麗婭，葉 鋒，吐爾洪·努爾，鐘 旗*

(1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000；2.新疆動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊830017)

布魯氏菌病是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人畜共患的傳染病，屬于我國規(guī)定的二類動物疫病。奶牛是Brucella病最易感的動物之一，主要損害其生殖系統(tǒng)，造成奶牛流產(chǎn)、不孕及乳房炎等癥，并可以經(jīng)污染的奶制品、流產(chǎn)物等途徑感染人，導(dǎo)致人的波狀熱、關(guān)節(jié)痛及泌尿生殖系統(tǒng)疾病[1]。因此，奶牛Brucella病嚴(yán)重危害奶牛業(yè)，并對公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重的威脅。

病原分離鑒定是診斷奶牛Brucella病的傳統(tǒng)方法，但以往病原體的分離主要以病料、流產(chǎn)胎兒、流產(chǎn)物等為分菌樣本，該類樣本數(shù)少，取樣困難，對操作人員安全危險性大[2]。本研究直接采集奶樣進行細菌分離，并采用PCR結(jié)合常規(guī)生化實驗鑒定了分離的Brucella，為新疆地區(qū)布病的診斷及防治提供了依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 采集自3個不同地區(qū)奶牛場SAT 檢測為陽性奶牛(抗體效價 1∶200～1∶800)的牛乳樣品25份，-20℃凍存?zhèn)溆?；布氏瓊脂培養(yǎng)基(BBLTMBrucella Agar)和TS液體培養(yǎng)基均購自Becton and Dickinson company公司；改良Brucella選擇添加劑(OXOID Ltd)、PCR所用試劑均購自北京莊盟生物有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；Brucella國際標(biāo)準(zhǔn)菌株牛種544A和羊種16M、國內(nèi)疫苗株牛種A19、羊種M 5及豬種S2、大腸桿菌DH5α均由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所Brucella病研究室保存。

1.2 細菌培養(yǎng) 將凍融的奶樣混勻，取300μL奶樣接種于含Brucella添加劑的布氏瓊脂培養(yǎng)基上，37℃5%～10%CO2培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。

1.3 布魯氏菌屬的PCR鑒定 挑取培養(yǎng)的疑似Brucella菌落置于含500μL TS液體培養(yǎng)基中，37℃孵育24h后100℃10m in，離心后取上清液作為PCR模板。采用VirB8-PCR方法擴增Brucella的VirB8基因，進行Brucella屬鑒定[3]。

1.4 布魯氏菌種和型的PCR鑒定 參照文獻[4]和[5]AMOS-PCR方法，組合插入序列IS711、牛種(1、2、4、3a 型)、牛種(5、6、9、3b 型)和羊種(1、2、3型)4個引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件：94℃5m in；94℃60s、60℃90s、72℃60s，40個循環(huán)；72℃10min。對Brucella分離株進行種型鑒定。

1.5 Bruce lla生物型的生化鑒定 按照布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)鑒定方法進行細菌學(xué)鑒定[6]。以Brucella國際標(biāo)準(zhǔn)菌株牛種544A和羊種16M為實驗參考株進行生化鑒定試驗，實驗中CO2需要量、H2S產(chǎn)生、染料抑制(硫堇、復(fù)紅)、單項血清凝集(A、M、R)等試驗結(jié)果均成立條件下判定分離菌株的生物亞型。

2 結(jié) 果

2.1 細菌分離培養(yǎng) 將奶樣接種于含Brucella添加劑的布氏瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第4d后，25份樣品有9份培養(yǎng)基上生長出0.5mm～2.0mm大小無色、閃光圓形、濕潤、凸起的疑似小菌落(圖1)。

2.2 PCR鑒定 應(yīng)用VirB8-PCR方法[3-4]對疑似Brucella菌落進行PCR鑒定，以A19疫苗株、羊種M 5株、豬種S2疫苗株和大腸桿菌DH5α分別為陽性對照和陰性對照。VirB8-PCR鑒定結(jié)果表明，9個Brucella分離株均擴增出約700bp的特異性片段，與陽性對照一致。陰性對照大腸桿菌DH5α則未見目的片段(圖2)。

2.3 Bruce lla種型PCR鑒定 采用AMOS-PCR方法[4-5,7]對VirB8-PCR陽性Brucella分離株進行種型鑒定，PCR結(jié)果表明牛種Brucella(1、2、4、3a型)擴增出約500bp的特異性片段，牛種Brucella(3b、5、6、9型)擴增出約1700bp的目的片段，羊種Brucella(1、2、3型)擴增出750bp的目的片段(圖3)。

2.4 生化鑒定 應(yīng)用常規(guī)生化試驗對PCR鑒定的牛種(3、5、6、9型)Brucella、羊種(1、2、3型)Brucella進行生物型鑒定。經(jīng)中國疾病與預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所Brucella病組鑒定表明，從2個牛場的牛乳中分離到的7株Brucella為牛種Brucella生物3型，1個牛場中分離的2株Brucella為羊種Brucella生物3型(表1)。

表1 牛乳中分離菌株生化鑒定結(jié)果Table 1The results of identification of isolated Brucella strains by biochem ical test in raw milk

3 討論

病原分離鑒定是診斷Brucella病的傳統(tǒng)方法和金標(biāo)準(zhǔn)，但采集病料困難，操作風(fēng)險大，方法繁瑣、分菌率低。牛乳中含有多種細菌，在細菌的分離過程中，常用的Brucella培養(yǎng)基中添加了改良的Brucella選擇性添加劑，有效地抑制了Brucella以外的各類細菌的生長，能分離到Brucella病原體。本實驗研究表明，對奶牛Brucella病同一感染群，SAT檢測奶牛Brucella病抗體效價為1∶200～1∶400時，奶牛的乳樣分菌率高達50%以上。該方法省時、簡便，取樣容易，一般在3d～5d內(nèi)就可得到病原體，為奶牛Brucella病的確診提供了切實可行的診斷方法，同時對生牛乳Brucella污染的監(jiān)測具有重要的食品衛(wèi)生學(xué)意義。

各型Brucella在各種動物間有跨物種間傳播，確認(rèn)動物感染群及其病原的種型，對確定流行病學(xué)狀態(tài)、傳染源及采取合適的防控措施有著重要的實用價值[8]。本研究結(jié)合PCR技術(shù)，快速準(zhǔn)確地對新疆地方Brucella分離株進行了種的鑒定。該方法減少了操作者在不可控情況下接觸活菌的機會，極大地降低了Brucella擴散污染的生物安全問題。應(yīng)用生化試驗確診了新疆地方Brucella分離株的生物亞型為牛種3型和羊種3型。從牛乳中分離到羊種Brucella 3型更進一步表明該地區(qū)Brucella羊種3型已成為該病流行的優(yōu)勢菌種[9]，這將嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)氐墓舶踩?。本研究結(jié)果為制定新疆地區(qū)Brucella病的防控措施提供了重要的參考價值。

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