還原型谷胱甘肽對(duì)失血性休克型急性肺損傷相關(guān)炎性因子及抗氧化因子的調(diào)控及肺損傷的保護(hù)作用研究

劉振威，高風(fēng)英，方 閱

在臨床中，失血性休克是由失血過(guò)多而造成休克的一種嚴(yán)重急癥。因?yàn)榉蔚慕Y(jié)構(gòu)比較特殊，所以最容易受到失血性休克帶來(lái)的影響，而急性肺損傷 (ALI)就是早期的影響，若繼續(xù)發(fā)展，可能會(huì)惡化成急性呼吸道窘迫綜合征 (ARDS)，嚴(yán)重危及患者的生命和健康。而治療和預(yù)后的關(guān)鍵在于患者是否能得到及時(shí)有效的復(fù)蘇。目前還原型谷胱甘肽已經(jīng)大量成功地運(yùn)用在腦缺血、急性腦損傷和心肌梗死等重要組織器官及其缺血再灌注損傷的治療中［1］;但尚未有文獻(xiàn)研究或報(bào)道還原型谷胱甘肽保護(hù)肺或其功能的作用。所以，筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)性大鼠失血性休克模型，將還原型谷胱甘肽應(yīng)用于ALI的復(fù)蘇，同時(shí)檢測(cè)其大鼠動(dòng)脈血漿中腫瘤壞死因子α(TNF－α)的含量、肺組織中超氧化物歧化酶 (SOD)含量、蛋白質(zhì)的含量以及支氣管肺泡灌洗液 (BALF)中中性粒細(xì)胞 (PMN)和肺泡巨噬細(xì)胞 (PAM)的數(shù)量，此外，還要檢測(cè)肺組織的含水率，并觀察肺組織的形態(tài)，以實(shí)現(xiàn)其保護(hù)ALI的研究，從而給臨床的應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)將其報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 動(dòng)物選擇 正常的SD大鼠24只，體質(zhì)量 (276.5±1.5)g，雌雄各一半 (上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部)。

1.1.2 試藥 人腫瘤壞死因子測(cè)試盒 (日本原裝進(jìn)口，批號(hào)20110417);人SOD測(cè)試盒 (上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)20110206);還原型谷胱甘肽快速測(cè)試盒 (上海逸峰生物科技有限公司，批號(hào)20110121)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 AU640型生化分析儀 (奧林帕斯公司制造);AXSYM型酶免分析儀 (雅培公司制造);ML780型生理記錄儀 (ADI公司制造);SF23000型血球計(jì)數(shù)儀 (東亞公司制造);H27500型透射電鏡 (東芝制造);DX5型光學(xué)顯微鏡(奧林帕斯公司制造)。

1.2 方法

1.2.1 制作實(shí)驗(yàn)性大鼠失血性休克SD模型 采用Wiggers的改良方法制作大鼠失血性休克［2］，并保持1.5h;然后進(jìn)行ALI，0.5h內(nèi)將肝素化的血液排凈，同時(shí)輸入相同量的林格氏液開始復(fù)蘇。用三通的接頭把生理記錄儀連接好，檢測(cè)此過(guò)程中心率 (HR)和平均動(dòng)脈壓 (MAP)的變化。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 將選好的健康大鼠隨機(jī)分成A組、B組和C組，每組各8只，給藥前12h內(nèi)，要求大鼠禁食但不禁水。失血性休克造模后，在進(jìn)行復(fù)蘇的過(guò)程中:將A組定為對(duì)照組，即僅給予手術(shù)，但不進(jìn)行休克模型的復(fù)制，同時(shí)給予靜脈注射1.5ml/kg的0.9%氯化鈉溶液;B組給予靜脈注射1.5ml/kg的0.9%氯化鈉溶液;C組給予靜脈注射40mg/kg的還原型谷胱甘肽。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

1.3.1 TNF－α檢測(cè) 分別在休克前、休克后1.5h、復(fù)蘇后1h、復(fù)蘇后3h取1ml的股動(dòng)脈血液，經(jīng)離心后取其血漿，并于－70℃冷藏，以腫瘤壞死因子測(cè)試盒中的操作方法去檢測(cè)TNF－α的含量。

1.3.2 BALF中蛋白質(zhì)、PMN和PAM檢測(cè) 手術(shù)完成后，立即摘取大鼠左肺，用0～4℃的0.9%氯化鈉溶液40ml分別灌洗肺和支氣管5次，將灌洗液收集起來(lái);然后以瑞氏液染色計(jì)數(shù)法測(cè)定BALF中PAM和PMN的數(shù)量，同時(shí)以甲紫染色計(jì)數(shù)法測(cè)定吞噬細(xì)胞的數(shù)量;計(jì)算其百分率，再乘以細(xì)胞的總數(shù)即為細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。以1500r/min的轉(zhuǎn)速將灌洗液離心5min，選擇上清液，按照考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)BALF中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.3 SOD的含量 選擇已處理好的大鼠肺部組織勻漿液，嚴(yán)格以測(cè)試盒的說(shuō)明方法去檢測(cè)SOD含量。

1.3.4 肺組織的含水率 即肺組織的含水率= (濕體質(zhì)量－干體質(zhì)量)/濕體質(zhì)量×100%。

1.3.5 肺組織的形態(tài) 在試驗(yàn)完成以后，取少量的肺部組織，用光鏡去觀察和記錄肺組織的形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以 ()表示，多組間比較采用多因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組血漿TNF－α水平比較 休克前3組血漿TNF－α水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);休克1.5h后、復(fù)蘇1h后、復(fù)蘇3h后3組血漿TNF－α水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);B組與C組在休克后1.5h和復(fù)蘇后與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

2.2 3組BALF中細(xì)胞數(shù)量和蛋白含量比較 3組BALF中細(xì)胞數(shù)量和蛋白質(zhì)含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。C組PMN數(shù)量與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);B組BALF中蛋白含量與A組、C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表2)。

2.3 3組復(fù)蘇后肺組織SOD、含水率比較 3組復(fù)蘇后肺組織中SOD與含水率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。A組與B組、C組的復(fù)蘇后肺組織中SOD與含水率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表3)。

2.4 3組肺組織形態(tài) 在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺泡壁情況，其中，A組相鄰的肺泡之間薄層的間質(zhì);B組肺泡的間質(zhì)變厚，粒細(xì)胞出現(xiàn)浸潤(rùn)，部分肺組織呈不張的狀態(tài);C組肺泡的間質(zhì)也變厚，但粒細(xì)胞出現(xiàn)浸潤(rùn)的程度明顯比B組輕。

表1 3組血漿TNF－α水平比較(，ng/L)Table 1 Comparison of plasma TNF－ α levels in 3 groups

表1 3組血漿TNF－α水平比較(，ng/L)Table 1 Comparison of plasma TNF－ α levels in 3 groups

組別 只數(shù) 休克前 休克1.5h后 復(fù)蘇1h后 復(fù)蘇3h后A組 8 53.88±3.56 73.56±11.1384.763±12.6597.84±14.83 B組 8 53.88±3.56 159.15±12.34236.56±41.50470.78±40.94 C組 8 54.37±4.85 135.58±12.12197.83±11.45323.53±18.32

表2 3組BALF中細(xì)胞數(shù)量和蛋白含量比較 ()Table 2 Comparison of cells number and protein content in BALF in 3 groups

表2 3組BALF中細(xì)胞數(shù)量和蛋白含量比較 ()Table 2 Comparison of cells number and protein content in BALF in 3 groups

組別 只數(shù) PAM數(shù)量(×109)PMN數(shù)量(×109)蛋白含量(ng/L)A組8 2.19±0.19 0.25±0.02 4.31±0.19 B組 8 1.18±0.15 2.39±0.19 7.02±0.23 C組8 1.19±0.18 1.39±0.21 5.43±0.21

表3 3組復(fù)蘇后肺組織中SOD與含水率比較 ()Table 3 Comparison of SOD and water content of lung tissue in 3 groups after resuscitation

表3 3組復(fù)蘇后肺組織中SOD與含水率比較 ()Table 3 Comparison of SOD and water content of lung tissue in 3 groups after resuscitation

組別 只數(shù) SOD(U/mg) 含水率 (%)A組5.78±0.15 76.14±0.956.28±0.42 71.42±1.91 B組 8 4.23±0.32 78.54±0.97 C組88

3 討論

因失血性休克引起的ALI，其發(fā)病的速度極快，具有較高的致死率。若能在改善休克的過(guò)程中，實(shí)現(xiàn)對(duì)器官的有效保護(hù)，避免出現(xiàn)ARDS，則不僅能使患者的恢復(fù)明顯加快，同時(shí)還能使失血性休克的致死率顯著降低。經(jīng)過(guò)大量的研究顯示，體內(nèi)TNF－α含量增加，會(huì)加劇失血性休克引起的ALI程度，且其增加的程度和 ARDS的發(fā)生有關(guān)［3－4］。通過(guò)及早地對(duì)TNF－α合成或釋放進(jìn)行干擾，則可有效保護(hù)ALI。于洋等［5］研究顯示通過(guò)給予抗TNF－α抗體能緩解體外循環(huán)中肺組織的損傷程度，且能使其損傷后的恢復(fù)過(guò)程中，有效減少感染和炎癥等情況的出現(xiàn)。由本次研究可看出，SD大鼠經(jīng)失血性休克造模后，其血漿中TNF－α的含量不斷增加，其中以復(fù)蘇后3h時(shí)最顯著;給予還原型谷胱甘肽后，其血漿TNF－α的含量增加的程度顯著減慢，說(shuō)明還原型谷胱甘肽能干擾TNF－α的合成和釋放，從而發(fā)揮其修復(fù)肺組織損傷的作用。但是還原型谷胱甘肽的作用機(jī)制目前還不清楚，還需要通過(guò)繼續(xù)的研究去證實(shí)。對(duì)試驗(yàn)中A組大鼠的TNF－α含量出現(xiàn)小幅增加的情況，推測(cè)可能是手術(shù)過(guò)程中損傷到局部的組織所造成的。

現(xiàn)代的研究已證實(shí)，PMN大量的在肺泡腔積聚，是引起ALI出現(xiàn)特征性改變的原因，對(duì)BALF中PMN的總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)可清楚地顯示其出現(xiàn)浸潤(rùn)的程度［6］。肺部毛細(xì)血管的通透性增大會(huì)改變肺損傷后的病理狀況，包括血管內(nèi)的蛋白質(zhì)和水分滲出，因此對(duì)BALF中的蛋白質(zhì)和含水量進(jìn)行測(cè)定可反映出肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的程度。經(jīng)研究顯示，在復(fù)蘇后B組和C組的BALF中蛋白質(zhì)含量、PMN數(shù)量和含水率都比A組高，說(shuō)明失血性休克會(huì)引起肺組織水腫等ALI癥狀，和光學(xué)顯微鏡的觀察到的結(jié)果相一致，即肺泡的間質(zhì)變厚、粒細(xì)胞出現(xiàn)浸潤(rùn)等情況。還原型谷胱甘肽可明顯改善以上狀況，充分證明其對(duì)肺組織有保護(hù)的作用。SOD能清除體內(nèi)的氧自由基，修復(fù)受損的細(xì)胞。因此給予氧自由基清除劑可有效降低組織器官衰竭的概率，從而避免組織出現(xiàn)損傷［7－8］。所以SOD活性檢測(cè)能很好地反映出組織細(xì)胞的抗氧能力，其中B組中SOD的活性比A組低，說(shuō)明在肺組織的損傷過(guò)程中，會(huì)因清除自由基的力度不夠，而加劇組織的損傷。還原型谷胱甘肽能增強(qiáng)SOD的活性，而C組中肺組織的SOD活性比B組高，提示對(duì)于失血性休克，及早地給予還原型谷胱甘肽，則能很好地清除體內(nèi)的氧自由基，減少受損細(xì)胞的數(shù)量，而起到保護(hù)肺組織及其功能的作用。

綜上所述，還原型谷胱甘肽可以降低血漿中TNF－α水平，緩解PMN浸潤(rùn)和肺水腫的程度，清除體內(nèi)的氧自由基，有效地保護(hù)ALI。這對(duì)于臨床上搶救失血性的休克，及減少肺部的并發(fā)癥等都具有特別重要的意義。

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