水楊酸對銅綠微囊藻的化感抑制作用

胡利靜　童桂香　黃光華　肖艷翼　劉騰飛　胡鯤　楊先樂　韋信賢

摘要：【目的】探討外源水楊酸對銅綠微囊藻生長及光合系統(tǒng)的影響，為將水楊酸應(yīng)用于除藻劑研發(fā)提供參考依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^人工培養(yǎng)的方法，利用分光光度計和各類試劑及試劑盒等對經(jīng)不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.12 g/L）水楊酸處理銅綠微囊藻的各指標(biāo)進(jìn)行測定，包括生長抑制率、葉綠素a、藻膽蛋白及總可溶性蛋白含量。【結(jié)果】水楊酸濃度越高，對銅綠微囊藻的抑制作用越明顯，以0.12 g/L水楊酸的抑制率最高，且抑制作用隨時間的延長而不斷增強(qiáng)，48 h后抑制率達(dá)95.66%。經(jīng)0.10 g/L水楊酸處理后，銅綠微囊藻的葉綠素a、藻膽蛋白及總可溶性蛋白含量基本維持在初始水平；0.12 g/L水楊酸能有效抑制銅綠微囊藻的葉綠素a含量，促使銅綠微囊藻中的藻藍(lán)蛋白（PC）含量相對降低、別藻藍(lán)蛋白（APC）含量相對上升，但藻紅蛋白（PE）含量基本維持在初始水平。【結(jié)論】水楊酸通過抑制銅綠微囊藻的葉綠素a等光合色素，阻遏其對光的捕獲及吸收，擾亂藻膽蛋白各組分構(gòu)成，從而致使藻類生長受抑，甚至死亡。即藻類葉綠素a是水楊酸抑制銅綠微囊藻生長的一個作用位點。

關(guān)鍵詞： 銅綠微囊藻；水楊酸；化感抑制；葉綠素a；藻膽蛋白

中圖分類號： S968.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）01-0169-05

Abstract：【Objective】The present study explored the effects of exogenous salicylic acid on growth and photosynthetic system of Microcystis aeruginosa， in order to provide basis for application of salicylic acid in algaecide research and development. 【Method】Through artificial culture， M. aeruginosa was treated with salicylic acid at different concentrations （0.02， 0.04， 0.06， 0.08， 0.10 and 0.12 g/L）. After that， growth inhibition rate， chlorophyll a， phycobiliproteins and total soluble protein content in M. aeruginosa were detected by spectrophotometer and various reagents and kits. 【Result】The higher the concentration of salicylic acid Nas， the more obvious the inhibitory effect on M. aeruginosa. When the concentration of salicylic acid was 0.12 g/L， the inhibitory effect was the strongest， and the inhibitory effect enhanced as time extended. The inhibition rate reached 95.66% after 48 hours. After treated with 0.10 g/L salicylic acid， chlorophyll a， phycobiliprotein and total soluble protein of M. aeruginosa maintained at initial level. While 0.12 g/L salicylic acid could effectively inhibit chlorophyll a. The content of phycocyanin（PC） was decreased and content of allophycocyanin（APC） was relatively increased， but content of phycoerythrin（PE） basically maintained at initial level. 【Conclusion】Salicylic acid inhibits the capture and absorption of light， and disturb component composition of phycobiliproteins by disturbing the composition of phycobiliprotein by inhibiting photosynthetic pigments of M. aeruginosa such as chlorophyll a， which results in inhibition of algae growth and even death. Therefore algae chlorophyⅡa is an action site for salicylic acid inhibiting growth of M. aeruginosa.

Key words： Microcystis aeruginosa； salicylic acid； allelopathy inhibition； chlorophyll a； phycobiliprotein

0 引言

【研究意義】藍(lán)藻水華的暴發(fā)不僅嚴(yán)重影響水域生物多樣性，阻遏水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，給水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)帶來巨大損失，其代謝產(chǎn)物微囊藻毒素還能直接或間接威脅人類健康（Codd et al.，2005；Smith et al.，2008）；而化感物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及其研究為控制藍(lán)藻水華提供較好的方向和思路（孫文浩和余叔文，1992；Nakai et al.，2000，2005；Wu et al.，2007）。化感物質(zhì)主要是植物（包括微生物）產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，其分子量小、結(jié)構(gòu)簡單，在自然生態(tài)系統(tǒng)條件下通常易降解，不易積累，生態(tài)安全性較好。因此，利用化感作用抑制水華藻類是當(dāng)前水產(chǎn)生態(tài)學(xué)研究的熱點和重點?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】迄今所發(fā)現(xiàn)的化感物質(zhì)幾乎都是植物次生代謝物，其中酚酸類化感物質(zhì)是自然水體中水生植物分泌的一類重要次生代謝產(chǎn)物，對多種水華藻類具有較強(qiáng)的化感活性（丁惠君等，2007；倪利曉等，2011）。Planas等（1981）在穗花狐尾藻萃取物中發(fā)現(xiàn)有12種酚和多酚物質(zhì)（如沒食子酸、鞣花酸）能抑制藻類生長；Gross等（1996）從狐尾藻中萃取獲得具有抑藻活性的多酚物質(zhì)（沒食子酸和鞣花酸）；喻景權(quán)和松井佳久（1999）從豌豆和黃瓜根分泌物中分別鑒定出苯甲酸、對羥基苯甲酸等多種具有抑制作用的酚酸類物質(zhì)；Nakai等（2000，2005）在研究穗花狐尾藻對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）的抑制作用時，發(fā)現(xiàn)穗花狐尾藻分泌物中含有焦酸、沒食子酸等酚酸類化感物質(zhì)。水楊酸（Salicylic acid，SA）是酚酸中的重要代表，是一種由植物體內(nèi)產(chǎn)生的簡單酚酸類化合物，廣泛存在于高等植物中，是抑菌劑和除藻劑的主要成分之一（齊秀東，2007）。鄭國興等（2006）以水楊酸為效應(yīng)物研究其酶學(xué)效應(yīng)和微生物效應(yīng)，結(jié)果表明，水楊酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3種細(xì)菌和白色假絲酵母、黑曲霉2種真菌均有明顯的抑制作用。吳安平等（2008）發(fā)現(xiàn)一定濃度的水楊酸能有效抑制水華魚腥藻的生長，其最佳抑藻濃度為0.6 mmol/L。閆浩等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸作用初期銅綠微囊藻胞外多糖和微囊藻毒素含量增加以應(yīng)對水楊酸造成的脅迫，但后期胞內(nèi)、外微囊藻毒素含量均有所下降?！颈狙芯壳腥朦c】目前，尚無有關(guān)水楊酸對銅綠微囊藻藻膽蛋白及光合系統(tǒng)影響的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以銅綠微囊藻為研究對象，探討外源水楊酸對銅綠微囊藻生長及光合系統(tǒng)的影響，以期為將水楊酸應(yīng)用于除藻劑研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

銅綠微囊藻藻種購自中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫——淡水藻種庫，編號為FACHB-434。銅綠微囊藻培養(yǎng)按淡水藻種庫提供的配方，采用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度（25±0.5）℃，光照強(qiáng)度3000 lx，光暗比12 h∶12 h，每天搖動3～5次。水楊酸（分析純）購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。主要儀器設(shè)備：智能型光照培養(yǎng)箱（MGC-250BPY-2型）、分光光度計（DU730）及低速冷凍離心機(jī)（Allegra X-15R）等。

1. 2 水楊酸對銅綠微囊藻的抑制作用

將水楊酸加入到處于指數(shù)生長期的銅綠微囊藻中，藻液初始OD為0.109，總藻液體積150 mL，錐形瓶中水楊酸最終濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.12 g/L；對照組用BG11培養(yǎng)基代替水楊酸溶液，每組設(shè)3個平行，每天同一個時間點測定銅綠微囊藻OD680 nm，其生長以O(shè)D變化量表示。

水楊酸對銅綠微囊藻生長抑制率（IR）的計算公式：

IR（%）=（1-N/N0）×100

式中，N為加入水楊酸組藻的OD680 nm，N0為對照組藻初始OD680 nm。

1. 3 生理生化指標(biāo)測定

1. 3. 1 葉綠素a含量測定 參考李慧敏等（2007）的方法，即取3.0 mL培養(yǎng)液，3500 r/min離心10 min，棄上清液，然后加入等體積90%甲醇（v/v），混合均勻。將混勻的溶液置于4 ℃黑暗條件下萃取6～8 h，然后3500 r/min離心10 min，取上清液，采用分光光度計測定其在665 nm處的吸光值，計算葉綠素a含量（c，μg/mL）。計算公式：c=13.9OD665 nm。

1. 3. 2 藻膽蛋白含量測定 參考吳忠興（2006）的方法，即取銅綠微囊藻液3.0 mL，10000 r/min離心5 min，棄上清液后加入3.0 mL PBS（0.05 mol/L，pH 6.8），置于-80 ℃超低溫冰柜中冷凍8 h，室溫暗處自然溶解，如此反復(fù)凍融3～4次，10000 r/min離心5 min，取上清液，用酶標(biāo)儀測定其在620、650和565 nm處的吸光值。根據(jù)下列公式分別計算藻膽蛋白各組分含量：

PC（mg/mL）=（OD620 nm-0.70OD650 nm）/7.38

AP（mg/mL）=（OD650 nm-0.19OD620 nm）/5.65

PE（mg/mL）=（OD565 nm-2.80PC-1.34AP）/1.27

1. 3. 3 總可溶性蛋白含量測定 取受試銅綠微囊藻3.0 mL置于10 mL離心管中，4000 r/min離心10 min，棄上清液，得到濃縮藻細(xì)胞。加入3.0 mL PBS（0.05 mol/L，pH 6.8）于濃縮藻細(xì)胞中，混合均勻，4000 r/min離心10 min，取0.05 mL上清液，采用南京建成生物工程有限公司試劑盒測定總可溶性蛋白質(zhì)量濃度（g/L）。

1. 4 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003和SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 水楊酸對銅綠微囊藻生物量的影響

2. 1. 1 水楊酸對銅綠微囊藻OD的影響 試驗觀察到，24 h后對照組銅綠微囊藻水體顏色較綠，而高濃度水楊酸處理組（0.10和0.12 g/L）的水體顏色開始由綠變黃，藻體蓄積、沉淀現(xiàn)象相較對照組明顯。由圖1可知，對照組銅綠微囊藻OD一直呈上升趨勢，0.02、0.04、0.06和0.08 g/L 4個水楊酸處理組的銅綠微囊藻OD也隨時間延長呈逐漸上升趨勢，但隨水楊酸濃度的增加，與同期對照組銅綠微囊藻OD的差距越明顯。0.12 g/L處理組的銅綠微囊藻OD下降趨勢最明顯，至48 h時已基本檢測不到銅綠微囊藻OD；而0.10 g/L處理組的銅綠微囊藻OD基本維持在初始水平，變化不明顯。

2. 1. 2 水楊酸對銅綠微囊藻抑制率的影響 由圖2可知，0.02 g/L水楊酸處理組在4 h時不僅沒有抑制藻生長，反而呈略微的促生長作用，但隨著時間的延長促進(jìn)作用逐漸轉(zhuǎn)為抑制作用。0.04、0.06和0.08 g/L 3個水楊酸處理組均表現(xiàn)出抑制作用，但各處理組間差異不明顯。從圖2還可看出，水楊酸濃度越高，對銅綠微囊藻抑制作用越明顯。其中，0.12 g/L水楊酸處理組對銅綠微囊藻的抑制率最高，且抑制作用隨時間延長而不斷增強(qiáng)，24 h后水楊酸對銅綠微囊藻的抑制率達(dá)80.82%，至48 h時抑制率達(dá)95.66%?；形镔|(zhì)對藻類化感作用的強(qiáng)弱與其濃度密切相關(guān)。已有研究表明，化感物質(zhì)對藻類的化感作用存在低促高抑現(xiàn)象（吳安平等，2008）。本研究中，水楊酸對銅綠微囊藻主要表現(xiàn)為抑制作用，且濃度越高抑制效果越強(qiáng)。

2. 2 水楊酸對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

由表1可看出，0.02、0.04、0.06和0.08 g/L 4個水楊酸處理組和對照組的銅綠微囊藻葉綠素a含量均隨時間推移而逐漸增加，至24 h時0.02、0.04和0.06 g/L 3個水楊酸處理組的銅綠微囊藻葉綠素a含量差異不顯著（P>0.05，下同），但0.02與0.08 g/L水楊酸處理組間差異顯著（P<

0.05，下同）。0.12 g/L水楊酸處理組的銅綠微囊藻葉綠素a含量在12 h時較低，與對照組間存在顯著差異，至96 h時已基本檢測不到；而0.10 g/L水楊酸處理組的銅綠微囊藻葉綠素a含量隨時間推移的變化較小，基本維持在初始水平。

2. 3 水楊酸對銅綠微囊藻藻膽蛋白含量的影響

銅綠微囊藻的藻膽蛋白包括藻藍(lán)蛋白（PC）、別藻藍(lán)蛋白（APC）和藻紅蛋白（PE），能將吸收的能量傳遞給藻細(xì)胞葉綠素a，即光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ），且這3種藻膽蛋白是藍(lán)藻光合作用捕光天線的主要功能團(tuán)。由圖3可知，0.02、0.04、0.06和0.08 g/L 4個水楊酸處理組的PC含量變化趨勢基本上與對照組一致，均在96 h時急劇上升；0.10 g/L水楊酸處理組的PC含量保持在初始水平；0.12 g/L水楊酸處理組的PC含量急劇下降，至96 h時基本檢測不到。由圖4可知，各水楊酸處理組間的APC含量變化較平緩，且隨時間推移的變化不明顯。由圖5可知，各水楊酸處理組間的PE含量在48 h內(nèi)基本維持不變，至96 h時各水楊酸處理組間的PE含量呈不同程度的上升趨勢，組間差異不明顯，但以0.12 g/L水楊酸處理組的PE含量增幅最低，基本維持在初始水平。

2. 4 水楊酸對銅綠微囊藻總可溶性蛋白含量的影響

由表2可看出，加入不同劑量水楊酸后銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)的總可溶性蛋白含量均呈下降趨勢。其中，經(jīng)0.02、0.04、0.06和0.08 g/L水楊酸處理48 h的銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)總可溶性蛋白含量分別為對照組的97.2%、94.4%、91.7%和88.9%；經(jīng)0.10 g/L水楊酸處理48 h時的銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)總可溶性蛋白含量為對照組的75.0%，96 h后為對照組的60.0%；而0.12 g/L水楊酸處理24 h的銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)總可溶性蛋白含量為對照組的66.7%，96 h后僅為對照組的2.2%?？梢?，經(jīng)高濃度水楊酸處理后，銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)總可溶性蛋白含量明顯下降，進(jìn)而影響藻細(xì)胞組織構(gòu)成，阻遏其正常的生長代謝，最終致使銅綠微囊藻細(xì)胞死亡。

3 討論

利用化感物質(zhì)進(jìn)行抑藻是研究藍(lán)藻水華防治途徑的一個熱點（吳安平等，2008）。酚酸類是一類重要的化感物質(zhì)，可快速抑制藻類生長，且能在自然條件下降解，生態(tài)安全性好，操作方便（Vyvyan，2002）。其中，水楊酸廣泛存在于高等植物中，是一種方便易獲得的小分子酚酸類化感物質(zhì)。本研究結(jié)果表明，水楊酸能有效抑制銅綠微囊藻生長，且濃度越高抑制效果越佳。吳安平等（2008）研究水楊酸對水華魚腥藻的化感抑制作用時，發(fā)現(xiàn)水楊酸對魚腥藻存在低促高抑現(xiàn)象，最佳抑制濃度為0.6 mmol/L，與本研究結(jié)果有所不同，可能是水楊酸的作用對象及使用劑量不同，從而引起不同的作用效果。

化感物質(zhì)可通過多種不同的途徑影響植物正常生長代謝，其中最常見的途徑是通過抑制PSⅡ活性來影響植物的光合作用，從而抑制植物生長（Weir et al.，2004）。Czarnota等（2001）研究表明，高粱根浸出液中的酚類物質(zhì)能通過與高等植物的QB位點結(jié)合，從而對高等植物的PSⅡ活性呈顯著抑制作用。Gog等（2005）研究表明，粗檸檬精油中的A2蒎烯和檸檬烯也能顯著抑制PSⅡ活性。本研究結(jié)果表明，水楊酸能抑制銅綠微囊藻葉綠素a合成，尤其在高濃度下對銅綠微囊藻葉綠素a的降解作用更明顯，從而降低銅綠微囊藻對光能的吸收、轉(zhuǎn)化，加速藻細(xì)胞死亡；經(jīng)高濃度（0.12 g/L）水楊酸處理銅綠微囊藻中的PC含量相對降低、APC含量相對上升，而PE含量基本維持在初始水平。因此推測，水楊酸能抑制銅綠微囊藻的葉綠素a等光合色素，阻遏銅綠微囊藻細(xì)胞對光的捕獲及吸收，降低藻細(xì)胞內(nèi)光反應(yīng)效率，抑制有機(jī)物、ATP等合成，從而擾亂銅綠微囊藻中藻膽蛋白各組分構(gòu)成，致使藻類生長受抑，甚至死亡。

4 結(jié)論

水楊酸通過抑制銅綠微囊藻的葉綠素a等光合色素，阻遏其對光的捕獲及吸收，擾亂藻膽蛋白各組分構(gòu)成，從而致使藻類生長受抑，甚至死亡。即藻類葉綠素a是水楊酸抑制銅綠微囊藻生長的一個作用位點。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）