結(jié)球甘藍(lán)雌蕊調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SPT基因的克隆與序列分析

楊樸麗 許俊強(qiáng) 劉智宇 王志敏 張丹華 湯青林 宋 明

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

結(jié)球甘藍(lán)雌蕊調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SPT基因的克隆與序列分析

楊樸麗 許俊強(qiáng) 劉智宇 王志敏 張丹華 湯青林*宋 明*

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

以結(jié)球甘藍(lán)E1為材料，提取花蕾總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)擬南芥SPT基因設(shè)計(jì)引物，采用同源克隆的方法從中克隆SPT基因序列1085 bp，開放閱讀框1062 bp。通過(guò)cDNA推導(dǎo)得到的氨基酸序列分析表明，BoSPT編碼353個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量為37.67 kD，pI為6.83。經(jīng)過(guò)EcoRⅠ和KpnⅠ限制酶雙酶切后，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET43.1a-BoSPT轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E. coli Rosetta （DE3），通過(guò)SDS-PAGE 檢測(cè)該蛋白的表達(dá)。經(jīng)Smart-embl預(yù)測(cè)其具有bHLH家族結(jié)構(gòu)域，位于序列第173～221位氨基酸殘基處。進(jìn)化樹表明結(jié)球甘藍(lán)BoSPT與擬南芥AtSPT和筷子芥AlSPT的親緣關(guān)系較近。BoSPT基因的原核表達(dá)得到純化的融合蛋白。

結(jié)球甘藍(lán)；雌蕊；SPT；基因克??；序列分析

雌蕊是種子植物的雌性繁殖器官，由心皮、花柱和子房組成并最終發(fā)育形成果實(shí)，其生長(zhǎng)發(fā)育情況對(duì)作物的產(chǎn)量、質(zhì)量都有決定性的影響，同時(shí)雌蕊發(fā)育的好壞對(duì)植物是否能夠繁殖也起到至關(guān)重要的作用。SPATULA（SPT）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)在植物花器官發(fā)育過(guò)程中起到重要作用的基因（Alvarez ＆ Smyth，1999）。Heisler等（2001）應(yīng)用原位雜交技術(shù)得出，SPT基因在花分生組織的頂部就開始表達(dá)，此部位隨后發(fā)育成雌蕊原基，SPT基因在雌蕊原基中部表達(dá)最強(qiáng)；隨著雌蕊原基的生長(zhǎng)發(fā)育，隨后繼續(xù)分化出隔膜、柱頭、花柱和輸送管，在此發(fā)育過(guò)程中不同組織中都有SPT基因的表達(dá)。直至開花前，在隔膜和柱頭上SPT基因的表達(dá)才消失，但在角果瓣片上卻可檢測(cè)到SPT基因的表達(dá)，然后隨著發(fā)育的進(jìn)程，SPT基因表達(dá)漸漸集中到瓣片邊緣，此部位會(huì)進(jìn)一步發(fā)育成瓣片分裂區(qū)，保證果實(shí)正常開裂。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，SPT功能缺失會(huì)導(dǎo)致隔膜和頂端心皮融合缺陷，以及傳輸束喪失和柱頭組織發(fā)育的減少（Heisler et al.，2001；Alvarez ＆ Smyth，2002）。由此推斷，SPT基因在整個(gè)雌蕊發(fā)育過(guò)程中是必不可少的。

擬南芥心皮發(fā)育還受到花器官確定基因AGA（AGAMOUS）和MADS-box成員CRABS CLAW（CRC）基因的調(diào)控（Alvarez ＆ Smyth，1999，2002）。Alvarez和 Smyth（1999）發(fā)現(xiàn)CRC可抑制正在發(fā)育的雌蕊的橫向生長(zhǎng)，促進(jìn)其軸向生長(zhǎng)。CRC基因的突變將引起雌蕊呈現(xiàn)較寬而短的結(jié)構(gòu)，且使兩心皮在頂點(diǎn)處呈非融合狀態(tài)（Fourquin et al.，2007）。AGA基因在花器官建成中為C組的基因，對(duì)于維持心皮生長(zhǎng)發(fā)育特性以及花柱頂端的生長(zhǎng)是不可缺少的（Gloz &Hudson，2002）。有研究發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因在心皮的發(fā)育過(guò)程中是平行起作用的，而并非上下游關(guān)系，SPT與這兩個(gè)基因的并聯(lián)行為調(diào)節(jié)成熟雌蕊所有元件，也有遺傳學(xué)的證據(jù)表明CRC可以增進(jìn)SPT與 AGA 的功能（Alvarez ＆ Smyth，1999；Fourquin et al.，2005）。Gremski等（2007）研究發(fā)現(xiàn)SPT與其他bHLH編碼的轉(zhuǎn)錄因子HECATE（HEC）在隔膜、傳輸束和柱頭重疊表達(dá)形成二聚體調(diào)控雌蕊生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中SPT除了可以調(diào)控雌蕊的發(fā)育外，在子葉（Josse et al.，2011）、葉片（Jorgensen ＆ Tyers，2004；Ichihashi et al.，2010）、根（Makkena ＆Lamb，2013）、果實(shí)（Girin et al.，2011；Groszmann et al.，2011）等器官中都有作用，同時(shí)對(duì)種子的萌發(fā)也起到了一定的作用（Penfield et al.，2005）。所以可以說(shuō)SPT的功能貫穿了植物的整個(gè)生命周期，但是SPT的主要功能是在雌蕊受精之前影響花器官的發(fā)育。因此對(duì)雌蕊調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SPT的研究是有重要意義的。

近年來(lái)，SPT在模式植物擬南芥中已有深入的研究，然而在其他作物中的報(bào)道還相對(duì)較少。擬南芥和甘藍(lán)（Brassica oleracea L.）同為十字花科草本植物，不同的是甘藍(lán)為蕓薹屬中重要的蔬菜作物。目前，趙燕等（2009）從薺菜（Capsella bursapastoris）中克隆到了與SPT相關(guān)的同樣影響雌蕊發(fā)育過(guò)程的CRC基因，但甘藍(lán)SPT基因的研究至今仍未見報(bào)道。本試驗(yàn)根據(jù)擬南芥SPT基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)同源克隆法從試驗(yàn)材料結(jié)球甘藍(lán)E1中得到了SPT基因。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行序列分析及同源性對(duì)比，結(jié)合原核體外表達(dá)技術(shù)，為后續(xù)在甘藍(lán)中SPT與其他蛋白如HEC的相互作用調(diào)控雌蕊生長(zhǎng)發(fā)育的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

結(jié)球甘藍(lán)E1由重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。種子播種和植株生長(zhǎng)均在RXZ 型智能人工氣候箱中，采用20℃/16 h光照與18℃/8 h黑暗的光周期，成苗后移栽于試驗(yàn)田，經(jīng)過(guò)冬季低溫春化。2013年3月取盛花期自交不親和系花柱于-80℃凍存，用于RNA提取。

根據(jù)擬南芥SPT基因序列（NCBI 登錄號(hào)NM_119857.2）設(shè)計(jì)引物對(duì)。SPT-F：5′-GCGgA ATTCATGGGAGATAAGAAATTGAT-3′；5′為帶保護(hù)堿基的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；SPT-R：5′-GCGgGTACCATGGATTCTGACATAATGAACA-3′；5′為帶保護(hù)堿基的KpnⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2 花蕾SPT基因的cDNA和gDNA的克隆與序列分析

根據(jù)擬南芥基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物BoSPT-F 和BoSPT-R用于cDNA 序列的擴(kuò)增，RT-PCR 擴(kuò)增體系為ddH2O15.4 μL，10×PCR 緩沖液2.5 μL，2mmol·L-1dNTP2.5 μL，25mmol·L-1mgSO41.6 μL，BoSPT-F/BoSPT-R 各1 μL，KODdNA 聚合酶0.5 μL，模板dNA0.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4℃3min；94℃30 s，50℃30 s，72℃30 s，38 個(gè)循環(huán)；72℃5min?；厥漳康钠畏謩e連接到pEASY-Blunt simple 載體，轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選后，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定并送測(cè)序。

1.3 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與體外表達(dá)

使用OMEGA Plasmidminiprep 試劑盒提取SPT目的基因質(zhì)粒，分別經(jīng)EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切后定向插入原核表達(dá)載體pET43.1a，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。提取重組質(zhì)粒并命名為pET43.1a-BoSPT分別經(jīng)EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定和華大基因公司測(cè)序驗(yàn)證。

將重組質(zhì)粒pET43.1a-BoSPT轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E. coliRosetta （DE3）。挑取單菌落，接種于5mL含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，過(guò)夜培養(yǎng)物按1︰100擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600在0.8～1.0時(shí)加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），按照L9（34）正交設(shè)計(jì)篩選融合蛋白表達(dá)條件（表1）。

表1 IPTG誘導(dǎo)原核表達(dá)條件的正交設(shè)計(jì)

1.4 融合蛋白純化

由1.3中確定的最佳條件培養(yǎng)含有pET43.1a-BoSPT 的E. coliRosetta （DE3），并按TOYOBOmagExtractor-His-tag-蛋白純化試劑盒說(shuō)明純化其體外表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)物。誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集菌體，使用Ni2+-NTA 柱（Qiagen）純化融合蛋白，以轉(zhuǎn)化pET43.1adNA空載體的E. coliRosseta 作為對(duì)照，SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoSPT基因克隆

提取花蕾RNA（圖1）反轉(zhuǎn)錄cDNA，設(shè)計(jì)引物克隆得到BoSPT基因cDNA序列，全長(zhǎng)1085 bp，開放閱讀框（ORF）1062 bp（圖2），GC含量54.37%。根據(jù)其cDNA序列推導(dǎo)得到BoSPT蛋白共353個(gè)氨基酸殘基序列，預(yù)測(cè)分子量為37.67 kD，等電點(diǎn)為6.83。

2.2 BoSPT基因序列分析

通過(guò)SignalP分析（http://genome.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-2.0/）該蛋白不含信號(hào)肽，PSORT及（TargetP http://genome.cbs.dtu.dk/ services/TargetP/）軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位表明，BoSPT蛋白位于細(xì)胞核中的可能性最大，在其他部位可能性較小，說(shuō)明BoSPT蛋白是一種核蛋白且由7個(gè)外顯子組成，編碼353個(gè)氨基酸。

圖1 甘藍(lán)總RNA電泳圖譜

圖2 SPT基因cDNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜

在線預(yù)測(cè)分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）表明，BoSPT蛋白具有bHLH家族結(jié)構(gòu)域，位于第173～221位氨基酸處，兩親性螺旋位于（DEISLFLRHII）第34～44位氨基酸殘基，是蛋白-蛋白相互作用的位點(diǎn)，且保守的兩親性螺旋可能也與共激活子蛋白作用。酸性結(jié)構(gòu)域（ETDGYDCESEEGVE）位于第139～152位氨基酸處，富含酸性殘基。兩個(gè)核定位信號(hào)（KRCR、KRRR）分別位于第169～172位氨基酸和第182～184位氨基酸處，該區(qū)域?qū)PT功能非常重要。Beta鏈位于第222～230位氨基酸處?？缒び蚍治霰砻鳎╤ttp://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），該蛋白不含跨膜區(qū)，且位于膜外（圖3）。

圖3 SPT核苷酸序列分析

2.3 BoSPT磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

用NetPhos2.0 Serve 軟件預(yù)測(cè)BoSPT基因翻譯后修飾，結(jié)果顯示BoSPT蛋白有可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)共有36個(gè)（圖4）。絲氨酸（Ser）有可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有31 個(gè)，分別在肽鏈的第9、10、12、15、22、25、31、32、48、49、53、61、85、102、125、130、131、132、133、137、148、167、168、180、186、202、209、276、296、309位和第314位氨基酸處；蘇氨酸（Thr）可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有3個(gè)，分別在肽鏈的第84、245位和第263位氨基酸處；酪氨酸（Tyr）可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有2個(gè)，分別在肽鏈的第91位和第144位氨基酸處。

圖4 BoSPT磷酸化位點(diǎn)分析

2.4 BoSPT進(jìn)化樹分析

經(jīng)氨基酸序列NCBI比對(duì)，BoSPT屬于轉(zhuǎn)錄因子超家族。序列分析結(jié)果顯示BoSPT具有動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄因子特有的bHLH結(jié)構(gòu)域。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到部分與BoSPT氨基酸序列同源性較高的高等植物蛋白家族氨基酸序列，經(jīng)ClustalX2比對(duì)，通過(guò)MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹（圖5），結(jié)果表明，結(jié)球甘藍(lán)BoSPT與擬南芥AtSPT（NM_119857）和筷子芥AlSPT （XP_002866965）位于相同的進(jìn)化枝上，與兩者的同源性最高（圖5）。

圖5 SPT蛋白分子進(jìn)化樹分析

2.5 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET43.1a-BoSPT，經(jīng)EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切可得到1060 bp左右條帶（圖6），表達(dá)質(zhì)粒送華大基因公司雙向測(cè)序，結(jié)果插入pET43.1a載體的位點(diǎn)和方向完全正確。

2.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE檢測(cè)

表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 結(jié)果（圖7）顯示，有pET43.1a-BoSPT重組蛋白表達(dá)的特異條帶出現(xiàn)（圖7，1～9泳道），其蛋白質(zhì)相對(duì)分子量均與預(yù)期值103.67 kD相符，而未誘導(dǎo)的菌液（對(duì)照）不見此條帶（圖7，0泳道）。由此證明表達(dá)質(zhì)粒pET43.1a-BoSPT構(gòu)建正確，且融合蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。由圖7看出在不同的誘導(dǎo)條件下，該融合蛋白均有較高的表達(dá)量，第2、3、4、6、7、8、9泳道的表達(dá)量相近，而1、5泳道的表達(dá)量相對(duì)較弱。本試驗(yàn)選用第7泳道（對(duì)應(yīng)表1中第7組的誘導(dǎo)條件，即0.1mmol·L-1IPTG在37℃誘導(dǎo)2 h，融合蛋白表達(dá)量最高，該條件為最佳培養(yǎng)條件），采用TOYOBOmagExtractor-His-tag-蛋白純化試劑盒純化體外表達(dá)的融合蛋白pET43.1a- BoSPT，純化后可得到目的條帶。

圖7 pET43.1a-SPT不同誘導(dǎo)條件的SDS-PAGE電泳圖譜

圖6 pET43.1a-BoSPT酶切電泳圖譜

圖8 純化的pET43.1a-BoSPT融合蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

2.7 融合蛋白純化檢測(cè)

根據(jù)2.6得出的結(jié)果確定含有pET43.1a-BoSPT 的E. coliRosetta （DE3）的最佳培養(yǎng)條件，并按TOYOBOmagExtractor-His-tag-蛋白純化試劑盒說(shuō)明純化其體外表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)物。誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集菌體，使用Ni2+-NTA柱（Qiagen）純化融合蛋白，以轉(zhuǎn)化pET43.1adNA空載體的E. coliRosseta 作為對(duì)照，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白，如圖8所示，純化的pET43.1a-BoSPT融合蛋白目標(biāo)條帶準(zhǔn)確清晰，目標(biāo)條帶預(yù)期值103.67 kD。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)同源克隆的方法從甘藍(lán)中獲得了SPT基因，編碼了353個(gè)氨基酸。經(jīng)ClustalX2比對(duì)，通過(guò)MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，可以看出，結(jié)球甘藍(lán)BoSPT與擬南芥AtSPT（NM_119857）和筷子芥AlSPT（XP_002866965）的同源性最高。從而在一定程度上說(shuō)明了這3個(gè)物種可能是由一個(gè)共同祖先進(jìn)化而來(lái)。將試驗(yàn)中克隆得到的SPT基因所編碼的BoSPT蛋白進(jìn)行NCBI比對(duì)，發(fā)現(xiàn)BoSPT屬于轉(zhuǎn)錄因子超家族。序列分析結(jié)果顯示在第173～221位氨基酸處BoSPT具有動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄因子特有的bHLH結(jié)構(gòu)域。bHLH區(qū)域含有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：一個(gè)保守的兩親性分子螺旋和一個(gè)酸性域，還帶有兩個(gè)保守的在bHLH域N末端重疊的核定位序列及一個(gè)Beta鏈。因?yàn)閎HLH家族結(jié)構(gòu)域可能具有與蛋白或DNA結(jié)合成二聚體的能力，所以在不同的器官中所結(jié)合的蛋白與基因可能是不相同的。這便可以在一定程度上解釋了為何葉片與心皮為同源組織，但在spt突變體中，葉片形狀和葉片不同組織發(fā)育完整沒(méi)有缺陷，而在花的心皮邊際卻有特異性組織發(fā)育缺陷（Alvarez ＆Smyth，1999；Fourquinetal.，2005；Ichihashietal.，2010）。

BoSPT蛋白在第139～152位氨基酸處具有酸性結(jié)構(gòu)域（ETDGYDCESEEGVE），富含酸性殘基，而SPT的酸性結(jié)構(gòu)域是心皮發(fā)育所必需的（Groszmannetal.，2008）。已有研究表明SPT酸性結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄助激活劑的作用位點(diǎn)?；A(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制是間接激活而不是直接激活。當(dāng)然在一些轉(zhuǎn)錄因子中，酸性域也被鑒定為直接的激活子，但是這一類轉(zhuǎn)錄因子只是富含酸性殘基，而不擁有嚴(yán)格的保守序列和結(jié)構(gòu)（Ptashne ＆gann，1997）。兩親性螺旋位于（DEISLFLRHII）第34～44位氨基酸殘基，兩親性螺旋結(jié)構(gòu)在心皮的發(fā)育過(guò)程中所起的作用并不像酸性結(jié)構(gòu)域那樣是必須的，但其對(duì)酸性結(jié)構(gòu)域起到支持作用（Groszmannetal.，2008）。兩個(gè)核定位信號(hào)（KRCR、KRRR）分別位于第169～172位氨基酸和第182～184位氨基酸處，Beta鏈位于第222～230位氨基酸處，有研究表明在與保守Beta鏈相鄰的bHLH的C末端的一個(gè)突變導(dǎo)致SPT功能缺失（Mitsuda ＆Ohme-Takagi，2009）。位于C端與bHLH 域毗鄰的Beta鏈的延伸對(duì)SPT心皮功能也是相當(dāng)重要，因其位于參與二聚化作用的bHLH域下游，可能提供額外的二聚化接觸點(diǎn)。它與bHLH-Zip蛋白的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的作用可能是平行的（Blackwood ＆ Eisenman，1991），都具有促進(jìn)其二聚搭檔特異性的作用（Souceketal.，1998）。目前，有研究報(bào)道顯示SPT和另一個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子HEC蛋白之間存在相互作用，形成二聚體可能調(diào)控下游的目標(biāo)基因（Gremskietal.，2007），然而，是否還存在其他能與SPT相互作用的蛋白還需進(jìn)一步的研究。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的學(xué)者在擬南芥的雌蕊發(fā)育調(diào)控機(jī)制方面接連取得重大進(jìn)展。這為其他作物，尤其是瓜果蔬菜等經(jīng)濟(jì)類作物的研究帶來(lái)了便利（蔣勵(lì)和張小蘭，2013）。本試驗(yàn)從結(jié)球甘藍(lán)中克隆得到甘藍(lán)雌蕊調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SPT基因并對(duì)其蛋白進(jìn)行體外原核表達(dá)檢測(cè)，可得到純化的pET43.1a-BoSPT融合蛋白且目標(biāo)條帶準(zhǔn)確清晰。表明SPT能在體外表達(dá)。下一步將對(duì)SPT基因所表達(dá)的蛋白與其他蛋白的相互作用進(jìn)行進(jìn)一步的研究，更加深入地了解SPT基因調(diào)節(jié)雌蕊發(fā)育的分子機(jī)制。為全面了解甘藍(lán)開花調(diào)控機(jī)制，并通過(guò)分子生物學(xué)方法來(lái)調(diào)控結(jié)球甘藍(lán)的雌蕊發(fā)育使達(dá)到生產(chǎn)、育種目標(biāo)奠定了理論基礎(chǔ)。

蔣勵(lì)，張小蘭.2013.植物果實(shí)發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理研究進(jìn)展.中國(guó)蔬菜，（6）：9-16.

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Moclecular Cloning and Sequence Analysis of SPTgene Transcription Factor Regulation of Pistil from Cabbage

YANG Pu-li，XU Jun-qiang，LIU Zhi-yu，WANG Zhi-min，ZHANGdan-hua，TANG Qing-lin*，SONGming*
（College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University，Key Laboratory of Horticulture Science for Southernmountainous Regions，Ministry of Education，Key Laboratory of Olericulture，Chongqing400715，China）

Taking cabbage（Brassica oleracea L.） E1 asmaterials，We extracted total RNA from capullo，reverse transcribed cDNA. According to SPTgene sequence of Arabidopsis，primers weredesigned and1085 bp SPTgene with1062 bp open reading frame（ORF）was cloned by homology cloning techniques. Thededuced BoSPT protein contained353 amino acids，with amolecular weight of37.67 kD and pI of6.83. Afterdouble enzyme of EcoRI and KpnI restriction enzymes，and then construct the recombinant plasmids pET43.1a-BoSPT. After transformation to E. coli Rosetta （DE3），the expression of recombinant proteins weredetected via SDS-PAGE. The structural analysis of BoSPT though Smart-embl showed that it contained bHLH familydomain，which located at the position of173-221 amino acid residues，The phylogenetic tree indicated that the BoSPT had closegenetic relationship with AtSPT and AlSPT. Prokaryotic expression showed that themolecularmass of BoSPT protein was purified.

Cabbage；Pistil；SPT；Moclecular cloning；Sequence analysis

S635.1

A

1000-6346（2013）20-0024-08

2013-06-22；接受日期：2013-08-14

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB113900），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31000908），重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011BA1002），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（XDJK2012B020），國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（201210635045）

楊樸麗，女，專業(yè)研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)，E-mail：yangpuli2008@163.com

*通訊作者（Corresponding authors）：湯青林，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種與發(fā)育調(diào)控，E-mail：swutql@163.com；宋明，男，教授，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)，E-mail：swausongm@163.com