結(jié)核分枝桿菌特異性效應(yīng)T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)鑒別兒童活動(dòng)性結(jié)核病與潛伏結(jié)核感染的價(jià)值

田建嶺 劉曉靈 孫 琳 焦偉偉 肖 婧 尹青琴 吳喜蓉 郭雅潔 韓 銳 李勤靜申阿東

結(jié)核病( TB) 目前仍是全球公共衛(wèi)生的主要問(wèn)題［1］。γ干擾素釋放試驗(yàn)( IGRAs) 通過(guò)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原( ESAT-6 和CFP-10) 刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞釋放的γ 干擾素，明確有無(wú)結(jié)核分枝桿菌感染，不會(huì)與卡介苗接種和其他環(huán)境分枝桿菌感染產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異度優(yōu)于結(jié)核菌素皮試［2，3］。目前有兩種商業(yè)化的試劑盒用于體外檢測(cè)γ 干擾素，一種是基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA) 法，檢測(cè)全血γ干擾素濃度，如QFT-GIT； 另一種是基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)( ELISPOT) 方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性效應(yīng)T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)( 簡(jiǎn)稱T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)) ，如結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)( T.SPOT.TB) ，其敏感度優(yōu)于ELISA 方法［4］。

IGRAs 檢測(cè)的結(jié)核分枝桿菌特異性效應(yīng)T 細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后釋放的γ 干擾素，在活動(dòng)性TB 與潛伏結(jié)核感染( LTBI) 中均有釋放，目前認(rèn)為IGRAs 不能區(qū)分活動(dòng)性TB 與LTBI，但兩者是結(jié)核分枝桿菌感染的不同階段。既往對(duì)TB 患兒在不同的抗結(jié)核治療階段應(yīng)用ELISPOT 進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)隨治療時(shí)間延長(zhǎng)有逐漸下降趨勢(shì)［5，6］，提示T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)的數(shù)量與感染的狀態(tài)有關(guān)。本研究應(yīng)用T.SPOT.TB 對(duì)兒童活動(dòng)性TB 與LTBI 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)的分布情況進(jìn)行分析，試圖回答T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)在兒童活動(dòng)性TB 與LTBI 間是否存在差異，是否可找到適當(dāng)?shù)陌唿c(diǎn)數(shù)界值以區(qū)分兒童活動(dòng)性TB 與LTBI。

1 方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院( 我院)結(jié)核病病房和門診診斷為活動(dòng)性TB 或LTBI 的0 ～18 歲行T.SPOT.TB 檢查結(jié)果陽(yáng)性且未經(jīng)過(guò)抗結(jié)核治療的病例。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①長(zhǎng)期使用免疫抑制劑，如糖皮質(zhì)激素等；②合并有其他重大疾病，如白血病、HIV 感染等。

1.3 倫理和知情同意 本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，行T.SPOT.TB 檢查為臨床需要，不會(huì)對(duì)研究對(duì)象產(chǎn)生不利影響。

1.4 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 TB 診斷標(biāo)準(zhǔn) 肺結(jié)核診斷參考《兒童肺結(jié)核的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方案( 試行) 》［7］，肺外結(jié)核參考《實(shí)用小兒結(jié)核病學(xué)》［8］。其中具有典型的臨床癥狀和影像學(xué)證據(jù)，同時(shí)經(jīng)病原學(xué)或組織病理學(xué)證實(shí)者，即為確診病例； 具有典型的臨床癥狀和影像學(xué)證據(jù)，同時(shí)具有活動(dòng)性TB 接觸史、PPD 試驗(yàn)陽(yáng)性、抗結(jié)核治療有效、排除其他肺部疾病4 項(xiàng)中任意2 項(xiàng)者，即為臨床診斷病例。結(jié)核性腦膜炎與血行播散型TB 為重癥TB［9］，余為非重癥TB。

1.4.2 LTBI 的診斷標(biāo)準(zhǔn) T. SPOT. TB 和( 或) PPD 皮試結(jié)果陽(yáng)性( 除外卡介苗接種反應(yīng)) ，且無(wú)TB 的相關(guān)臨床表現(xiàn)及X 線胸片無(wú)TB 特征的患兒。

1.5 分組考慮 依據(jù)本文試圖回答的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)在兒童活動(dòng)性TB 與LTBI 間是否存在差異，將進(jìn)入分析的病例分為活動(dòng)性TB 組和LTBI 組，由于活動(dòng)性TB 中包含重癥TB 和非重癥TB，活動(dòng)性TB 組T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)是否會(huì)受到重癥TB 和非重癥TB 的影響，因此在活動(dòng)性TB 組中再分為重癥TB 亞組和非重癥TB 亞組。

1.6 實(shí)驗(yàn)操作

1.6.1 PPD 試驗(yàn) 患兒前臂皮內(nèi)注射0.1 mL( 含5 U 的PPD) ，注射后48 ～72 h 測(cè)量皮試硬結(jié)大小。記錄硬結(jié)平均直徑=( 橫徑+ 縱徑) /2，反應(yīng)大小以mm 記錄。PPD 試驗(yàn)陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)文獻(xiàn)［8］：原發(fā)或繼發(fā)免疫功能低下、營(yíng)養(yǎng)不良和重癥TB 患兒以≥5 mm 為陽(yáng)性； 其他患兒以≥10 mm為陽(yáng)性，同時(shí)能除外卡介苗接種后的免疫反應(yīng)。

1.6.2 IGRAs 操作按T 細(xì)胞檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書［4］進(jìn)行( T.SPOT.TB) ，取外周靜脈血2 ～4 mL，室溫下放置并于4 h內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，用無(wú)菌淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，向微孔培養(yǎng)板4 個(gè)孔中分別加入50 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液( 空白對(duì)照) 、ESAT-6( 抗原A) 、CFP-10( 抗原B) 和PHA( 陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照液) ，每個(gè)孔中加入100 μL 細(xì)胞終溶液( 含有25 萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞) ，將微孔培養(yǎng)板置于37℃5%的CO2培養(yǎng)中孵育16 ～20 h，應(yīng)用1 × PBS 洗板，加入二抗置于4℃1 h，顯色底物進(jìn)行顯色，使用酶聯(lián)斑點(diǎn)圖像自動(dòng)分析儀進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。

T.SPOT.TB 陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)： 滿足以下任一項(xiàng)，①空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0 ～5 個(gè)且( 抗原A 或抗原B 孔斑點(diǎn)數(shù)) -( 空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)) ≥6； ②空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6 ～10且( 抗原A 或抗原B 孔的斑點(diǎn)數(shù)) ≥2 ×( 空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)) 。

陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)： 陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照孔結(jié)果良好( 斑點(diǎn)數(shù)≥20) ，但抗原A 或抗原B 孔斑點(diǎn)數(shù)均達(dá)不到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。

T.SPOT.TB 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)為分別計(jì)算抗原A 和B孔與空白對(duì)照孔差值，取最大值； 抗原A 和B 孔T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)為相應(yīng)抗原孔斑點(diǎn)數(shù)與空白對(duì)照孔的差值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 活動(dòng)性TB 組( 重癥和非重癥TB 亞組)與LTBI 組T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)用中位數(shù)( 范圍) 表示，組間斑點(diǎn)數(shù)比較采用Mann-Whitney U 秩和檢驗(yàn)，組內(nèi)T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。ROC 曲線分析T. SPOT. TB抗原孔T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)，尋找區(qū)分活動(dòng)性TB 與LTBI 的最佳界值，計(jì)算曲線下面積( AUC) 、敏感度和特異度及其95%CI。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 17.0軟件行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 5.0 用于作垂直散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 圖1 顯示，2011 年1 月至2012 年8 月依據(jù)本文納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)入分析的活動(dòng)性TB 和LTBI 病例共140 例?；顒?dòng)性TB 組與LTBI 組病例的基本臨床信息如表1 所示，活動(dòng)性TB 組19 例為病原學(xué)確診病例，余為臨床診斷病例。重癥TB 亞組27 例，非重癥TB 亞組66 例。

圖1 病例篩選入組流程圖Fig 1 Flow chart of case selection process

表1 研究對(duì)象信息( n)Tab 1 Characteristics of pediatric patients studied( n)

圖2 顯示，活動(dòng)性TB 組T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)中位數(shù)為84(6 ～710) ，顯著高于LTBI 組的17(6 ～316) ，P =0.000； 非重癥TB 亞組T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)中位數(shù)為99( 6 ～710) ，顯著高于重癥TB 亞組的44(6 ～268) 和LTBI 組的17(3 ～316) ，P分別為0.011 和0.000；重癥TB 亞組T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)和LTBI組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P=0.084) ，但4 組間T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)有較大范圍重疊。抗原A 孔和抗原B 孔T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)中位數(shù)在活動(dòng)性TB 組和LTBI 組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，抗原A 孔：46( -1 ～557) vs 13( 0 ～316) ，P =0.000； 抗原B 孔：35( -3 ～710) vs 12(2 ～297) ，P =0.001；抗原A 孔T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)中位數(shù)在兩組中均高于抗原B 孔，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 活動(dòng)性TB 組P=0.926，LTBI 組P=0.541) 。

表2 顯示，區(qū)分活動(dòng)性TB 和LTBI，T.SPOT.TB、抗原A和抗原B 孔T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)ROC AUC 分別為0.731(95%CI：0.642 ～0.819) ，0.725(95%CI：0.638 ～0.811) 和0.680(95%CI：0.587 ～0.774) ；區(qū)分非重癥TB 和LTBI，重癥TB 和LTBI，重癥TB 和非重癥TB 的ROC AUC 分別為0.775 (95%CI：0.688 ～0.863) ，0.621( 95%CI： 0.486 ～0.757) ，0.668(95%CI，0.549 ～0.787) 。以T.SPOT.TB 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)區(qū)分LTBI 與活動(dòng)性TB 的準(zhǔn)確性最佳，T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)界值為43.5，敏感度與特異度分別為69.9%和70.2%；區(qū)分非重癥TB 和LTBI 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)界值為44，敏感度和特異度分別為77.3%和70.2%，區(qū)分非重癥TB 和重癥TB 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)界值為44.5，敏感度和特異度分別為77.3%和51.9%。

圖2 活動(dòng)性TB、重癥和非重癥TB、LTBI 患兒T.SPOT.TB 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)比較Fig 2 Dot plots of effector T-cell spots above negative control in children with active TB，severe TB，non-severe TB and LTBI

表2 活動(dòng)性TB、重癥TB、非重癥TB 和LTBI 兒童T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)ROC 曲線分析Tab 2 ROC curve analysis of T. SPOT. TB spots among children with active TB，severe and non-severe TB and LTBI

隨T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)界值取值的增大，區(qū)分LTBI 與活動(dòng)性TB 的敏感度逐漸降低，特異度、陽(yáng)性似然比和陰性似然比逐漸升高( 表3) 。

表3 不同T.SPOT.TB 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)界值區(qū)分兒童活動(dòng)性TB與LTBI 的敏感度、特異度及似然比Tab 3 Sensitivity，specificity and LR of different cut-off values in differentiating active TB from LTBI

3 討論

本研究對(duì)T.SPOT.TB 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)分析顯示，活動(dòng)性TB 組T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)中位數(shù)顯著高于LTBI 組(84 vs 17) ，其中非重癥TB 亞組( 99) 顯著高于重癥TB 亞組( 44) 和LTBI 組(17) ，提示活動(dòng)性TB 與LTBI 組T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)的差異主要源于非重癥TB。T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)在活動(dòng)性TB 組明顯高于LTBI 組，提示其數(shù)量可從一定程度上反映了體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌負(fù)荷的程度，進(jìn)一步的ROC 曲線分析顯示，T.SPOT.TB 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)的AUC( 0.731) 高于抗原A 孔(0.725) 和抗原B 孔(0.680) ，提示區(qū)分活動(dòng)性TB 與LTBI的準(zhǔn)確性以T.SPOT.TB 最佳，相應(yīng)的斑點(diǎn)數(shù)界值為43.5，敏感度和特異度分別為69.9%和70.2%。另外，從表3 可見隨T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)界值增大，其區(qū)分活動(dòng)性TB 與LTBI 的特異度逐漸升高，界值為185 時(shí)的特異度達(dá)95.7%，較高的特異度對(duì)臨床診斷兒童活動(dòng)性TB 具有一定的指導(dǎo)意義。

Latorre 等［10］應(yīng)用T. SPOT. TB 的研究顯示，T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)在兒童活動(dòng)性TB(12 例) 與LTBI(61 例) 間無(wú)顯著性差異，ROC AUC 為0.596，T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)界值為145 對(duì)應(yīng)的敏感度和特異度分別為25%和80%，作者考慮與兒童結(jié)核感染通常為近期感染，機(jī)體反應(yīng)程度在活動(dòng)性TB 和LTBI間相似有關(guān)。本研究以T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)界值特異度≥80%作為區(qū)分活動(dòng)性TB 與LTBI 的理想界值時(shí)，其敏感度是文獻(xiàn)［10］的近2 倍(47.3% vs 25%) ，而T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)界值較低(94.5 vs 145) ，考慮可能與入組人數(shù)(73 vs 140) 、活動(dòng)性TB 和LTBI 人數(shù)比例(12/61 vs 93/47) 以及PPD 試驗(yàn)陽(yáng)性比例的不同有關(guān)。成人研究顯示T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)在PPD 試驗(yàn)陽(yáng)性組高于陰性組，將兩者合并分析時(shí)界值低于僅分析PPD 試驗(yàn)陽(yáng)性人群［10］。

T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)在成人活動(dòng)性TB 亦顯著高于LTBI( P ＜0.001) ，但也因T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)分布在兩人群間有較大范圍的重疊，而 不 能 區(qū) 分 活 動(dòng) 性TB 與LTBI［10～12］。Latorre等［10］和Janssens［12］等應(yīng)用ROC 曲線分析尋找區(qū)分活動(dòng)性TB 和LTBI 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)界值，文獻(xiàn)［10］( 活動(dòng)性TB 37例，LTBI 85 例) 顯示以抗原A 孔T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)區(qū)分活動(dòng)性TB 與LTBI 最佳( AUC 0.677) ，以T.SPOT.TB 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)區(qū)分活動(dòng)性TB 與LTBI 的最佳界值為50，敏感度為70.3%，特異度為56.5%。文獻(xiàn)［12］( 活動(dòng)性TB 57 例，LTBI 127 例) 顯示以T.SPOT.TB 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)的準(zhǔn)確性最佳( AUC 0.805) ，界值為49.5，敏感度和特異度分別為82.8%和74.2%，兩研究間結(jié)果的不一致可能與入組研究對(duì)象人數(shù)不同有關(guān)。本研究也顯示，T.SPOT.TB 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)分布在活動(dòng)性TB(6 ～710) 、重癥TB(6 ～268) 、非重癥TB(6 ～710) 和LTBI(3 ～316) 間有較大范圍重疊，提示不能用T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)的數(shù)量區(qū)分活動(dòng)性TB 和LTBI，也不能區(qū)分重癥和非重癥TB，與成人研究結(jié)果一致。但菌負(fù)荷多的重癥TB 亞組T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)比非重癥TB 少，考慮與高菌負(fù)荷的個(gè)體體內(nèi)抗原特異性T 細(xì)胞產(chǎn)生效率較低有關(guān)［13］。

本研究入組的研究對(duì)象多數(shù)在T. SPOT. TB 檢測(cè)前已行PPD 試驗(yàn)，但間隔時(shí)間未超過(guò)3 d，因PPD 試驗(yàn)先于T.SPOT.TB 有可能產(chǎn)生復(fù)強(qiáng)效應(yīng)干擾T 細(xì)胞斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。成人研究顯示PPD 試驗(yàn)對(duì)IGRAs 的影響主要出現(xiàn)在PPD 陽(yáng)性人群［14～18］，PPD 試驗(yàn)后3 d 內(nèi)查IGRAs 是安全的［15，18］，而皮試后第7 天的γ 干擾素濃度和T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)較皮試當(dāng)日有明顯升高［18］。Richeldi 等［19］對(duì)有結(jié)核病暴露史的兒童同時(shí)應(yīng)用PPD、QFT-G(70 例) 與QFT-GIT(81 例) 進(jìn)行篩查，并在8 ～11 周后復(fù)查QFT，未發(fā)現(xiàn)PPD 試驗(yàn)前后γ 干擾素水平有明顯變化，認(rèn)為不會(huì)造成IGRAs 的假陽(yáng)性反應(yīng)。

4 結(jié)論

兒童活動(dòng)性TB 尤其是非重癥TB 的T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)顯著高于LTBI 兒童，T 細(xì)胞斑點(diǎn)的數(shù)量從一定程度上反映了體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌負(fù)荷程度；因T 細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)在活動(dòng)性TB與LTBI 間有較大范圍重疊，且其界值區(qū)分兩者的敏感度和特異度均較低，故不適用于兒童LTBI 與活動(dòng)性TB 的鑒別診斷。

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