番木瓜DNA提取與性別分子鑒定——遺傳學綜合性實驗

申艷紅，陳曉靜

（福建農林大學 園藝學院，園藝植物遺傳育種研究所，福建 福州 350002）

為了適應基因工程和基因組學的快速發(fā)展，在遺傳實驗教學中增加了“植物基因組DNA的粗提與鑒定”實驗［1］。但是該實驗為驗證性實驗，學生只能按部就班地完成實驗步驟，學生處于被動接受的地位，不利于培養(yǎng)學生的分析問題和解決問題的能力［2］；而且這樣的實驗不能說明任何生物學問題，學生積極性不高。為了更好培養(yǎng)學生的實踐動手能力、創(chuàng)新設計能力和科學研究能力，設計了“番木瓜DNA提取與性別分子鑒定”綜合性實驗。該實驗將基因組DNA提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳和分子標記分析整合到一個實驗中。通過對本實驗的操作，學生學習了移液槍、離心機、PCR儀和電泳儀等常用分子遺傳學研究儀器的使用方法，了解基因工程和基因組學研究的基本方法。而且通過本實驗，學生可以清楚認識到分子標記輔助選擇的神奇功能，簡單的PCR操作就可以將番木瓜的兩性株和雌株分辨開，大大地激發(fā)了學生的學習興趣。

1 材料

植物材料：實驗用新鮮番木瓜葉片采自福建農林大學校園。

試劑：SDS、CTAB、Tris、EDTA、NaCl、PVPP、乙醇、氯仿和異戊醇均為國產分析純；ExTaq、dNTPs等購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒購自北京天澤基因工程有限公司。

2 實驗方法

2.1 DNA提取

（1）改良2×CTAB法。參照植物基因工程［3］的方法，并加以改進。

① 取番木瓜葉片0.1g并剪碎放入研缽中，加入1 mL提取緩沖液（0.02g／mL CTAB，1.4mol／L NaCl，20 mmol／L EDTA，100mmol／L Tris－HCl），加少許PVPP，充分研磨至漿糊狀；然后用1mL提取緩沖液將糊狀物洗入2mL的離心管中，65℃水浴15min。

②4℃、13000r／min離心10min。

③ 取上清，加入體積比為24∶1的氯仿和異戊醇，劇烈振蕩，4℃、13000r／min，離心10min。

④取上清，加入2倍體積的無水乙醇，輕輕向一個方向轉動試管，可見有白色絮狀沉淀出現，即為DNA。

⑤ 用槍頭將絮狀物挑出到1.5mL離心管中，用500μL、75%乙醇洗滌沉淀，4℃、10000r／min，離心5min。

⑥ 用移液槍吸取上清，棄掉，放在50℃烘箱中5min，以除去乙醇。

⑦ 加入50～100μL ddH2O溶解沉淀，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）SDS－KAc小量提取法。參照何瑋毅等［4］的方法，并簡化了步驟。

① 稱取番木瓜葉片0.1g，加入1500μL、緩沖液 （500mmol／L NaCl；pH 8.0 的 100mmol／L Tris－HCl；50mmol／L EDTA），加少許PVPP，迅速研磨成勻漿，轉移至2mL離心管中，加入100μL 20%SDS，65℃溫育15min。

② 加入300μL KAc，放入4℃冰箱10min，4℃、13000r／min離心10min；之后步驟同方法（1）的③—⑦步。

（3）2×CTAB＋質粒提取試劑盒法。將番木瓜葉片于2×CTAB緩沖液中研磨成勻漿，65℃溫育15 min后，離心，然后將上清液加入質粒提取試劑盒的柱子中，其余步驟參照試劑盒使用說明書。

（4）SDS－KAc＋質粒提取試劑盒法。完成方法（2）的①、②步后，將上清液加入質粒提取試劑盒的柱子中，其余步驟參照試劑盒使用說明書。

2.2 DNA質量檢測

取3μL DNA樣品并稀釋100倍，在TU－1901型紫外分光光度計上測定A260、A280，并計算檢測DNA的純度、濃度和產率。計算 DNA濃度c：c／（mg·L－1）＝A260×50×100。各取8μL DNA樣品，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。各取8μL DNA樣品用Sau3AI與EcoR I酶切，將酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果。

2.3 番木瓜性別連鎖SCAR標記的擴增

根據Deputy等［5］發(fā)表的番木瓜性別連鎖SCAR標記合成引物，上游引物 T12－F：5′－GGGTGTGTAGGCACTCTCCTT－3′，下游引物 T12－R：5′－GGGTGTGTAGCATGCATGATA －3′，片段長度為800bp。利用番木瓜Actin基因保守區(qū)做陽性對照［6］，上游引物為5′－CACTGCTGAGCGGG AAATTGT－3′，下游引物為5′－GATCCTCCAATCCAGACACTGT－3′，片段長度為426 bp。以提取的番木瓜基因組DNA為模板，擴增性別連鎖SCAR標記。PCR擴增程序：94℃預變性5min；35個擴增循環(huán)的94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s；最后72℃繼續(xù)延伸7min。擴增PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3 實驗結果及4種DNA提取方法的比較

由電泳結果可以看出，4種方法提取的番木瓜基因組DNA條帶完整、清晰，說明沒有降解。2×CTAB法和SDS－KAc法DNA的得率比與試劑盒結合的方法高，但是這2種方法RNA污染嚴重，而且點樣孔稍亮，說明有蛋白質污染（見圖1）。采用分光光度計測定OD值，2×CTAB法與SDS－KAc法提取的DNA A260／A280接近2，A260／A230均為2.16（見表1）。如果單從數據上看，這2種方法提取的DNA質量很高，沒有RNA、蛋白質以及小分子雜質的污染。但是從DNA電泳圖譜已經看出，這2種方法獲得的僅是粗提DNA，既有RNA污染，又有蛋白質污染，因此粗提得到的DNA不適于用分光光度法分析其質量。Sau3AI與EcoR I酶切結果表明，采用這4種方法提取的DNA均能被完全酶切（見圖2）。分別以這4種方法提取的DNA為模板，擴增番木瓜Actin保守區(qū)，均能擴增出目的條帶（見圖3），說明4種方法所提取的DNA質量可以滿足PCR擴增的要求。

表1 番木瓜葉片DNA的紫外分光光度計測定結果

圖1 番木瓜DNA電泳圖譜

圖2 番木瓜DNA的Sau3AI和EcoRI酶切

圖3 番木瓜Actin基因的擴增

采用2×CTAB法分別提取了兩性株與雌株的基因組DNA，分別擴增番木瓜Actin基因和SCAR性別連鎖標記。將PCR產物跑電泳，結果如圖4所示，兩性株和雌株都能擴增出Actin基因，但是只有兩性株能擴增出SCAR標記，說明SCAR標記僅出現在兩性株的基因組中，因此PCR擴增可以鑒定番木瓜性別。

圖4 番木瓜性別連鎖SCAR標記的擴增

4 討論

番木瓜株性復雜，有雄株、雌株和兩性株，是研究植物性別決定的模式植物。早在20世紀30年代，Hofmeyr［7］和Storey［8］就推斷番木瓜的性別受3個復等位基因控制，雄株、兩性株及雌株的基因型分別為M1m、M2m、mm。Horovitz和Jimenez［9］根據屬間雜交的結果提出番木瓜性別是由性染色體決定的，屬于經典的XXXY型。隨著研究的深入，Liu等［10］認為番木瓜包含一個原始的Y染色體，其雄性特異區(qū)域可能與2億4千萬到3億2千萬年前人Y染色體的祖先相似。

番木瓜雄株一般不結果，雌株和兩性株均能結果，但是雌株果實果腔大、果肉薄，市場價值不如兩性株果實。番木瓜性別分化較遲，一般在開花后才能準確鑒別其性別，因此在生產中果農總是1個穴中種2～3株小苗，等到7～9個月開花后再將雄株和雌株拔掉，這在生產上造成極大的浪費［11］。因此，番木瓜性別早期鑒定在番木瓜生產上具有重要意義。Deputy等［5］獲得了與番木瓜性別緊密連鎖的2個RAPD標記，并將其轉化為SCAR標記。SCAR T12在兩性株上能擴增出約800bp的特異條帶，而在雌株中不出現，重復性良好，能很好地將兩性株和雌株區(qū)分開，在生產上具有重要應用價值。

番木瓜是熱帶、亞熱帶常種果樹，在我國廣東、廣西、云南、臺灣、福建等地廣泛種植［12］。在福州，番木瓜全年開花，雌花沒有雄蕊，花型胖大，兩性花既有雌蕊又有雄蕊，花型瘦小，容易分辨，方便學生自己動手采集、處理材料，完成實驗全過程。

常規(guī)植物組織DNA提取方法中，一般將植物組織放在液氮中研磨成粉末，這樣有利于抑制DNAase的作用，以防DNA降解。在我們所用的4種方法中均沒有使用液氮，因為液氮價格較貴，而且易揮發(fā)，不容易保存。本研究中，將番木瓜葉片直接放在提取緩沖液中，室溫下進行研磨，未見DNA降解，效果良好。實驗證明，4種方法提取的DNA雖然都有些雜質污染，但是可以進行PCR擴增、酶切鑒定等實驗。4種方法與傳統(tǒng)DNA提取方法［3］相比，簡化了多個實驗步驟，因此大大節(jié)約了操作時間。傳統(tǒng)DNA提取大約2h，而這4種改進方法只需約1h就可以完成。2×CTAB法比SDSKAc法少1個步驟，可以節(jié)約10min時間。與試劑盒結合的方法又比上面2種方法節(jié)約10min時間。因此，如果沒有時間上的考慮，完全可以選用前面2種傳統(tǒng)方法，而且全部用的是常規(guī)藥品，價格便宜。其實，植物基因組DNA提取試劑盒種類很多，效果也不錯，作者之所以選用質粒提取試劑盒，也是出于價格的考慮。天澤柱式植物DNA提取試劑盒50次包裝的價格為390元，而天澤柱式質粒提取試劑盒100次包裝的價格僅為99元。因此，在教學經費短缺，又想讓學生感受柱式植物DNA提取時，采用2×CTAB或SDS－KAc＋質粒提取試劑盒法是不錯的選擇。

（References）

［1］申艷紅，陳曉靜.適合本科教學的“DNA粗提與鑒定”實驗［J］.生物學通報，2008，43（12）：33－34.

［2］皮妍，林娟，郭濱，等.改革遺傳學實驗教學方法培養(yǎng)新型創(chuàng)新人才［J］.實驗室研究與探索，2008，27（10）：86－88.

［3］王關林，方宏筠.植物基因工程［M］.2版.北京：科學出版社，2005：755.

［4］何瑋毅，陳曉靜，申艷紅，等.番木瓜組培苗葉片基因組DNA的微量提?。跩］.福建農林大學學報：自然科學版，2009，38（1）：34－38.

［5］Deputy J C，Ming R，Ma H，et al.Molecular markers for sex determination in papaya（Carica papayaL）［J］.Theor Appl Genet，2002，106（1）：107－111.

［6］申艷紅，陳曉靜，何瑋毅，等.番木瓜肌動蛋白CpActin基因的克隆及在果肉中的表達研究［J］.果樹學報，2010，27（6）：859－862.

［7］Hofmeyr J D J.Genetical studies of Carica papayaL［J］.South African Department of Agriculture and Science Bulletin，1938，187：64.

［8］Storey W B.Segregation of sex types in Solo papaya and their application to the selection of seed［J］.American Society for Horticultural Science Proceedings，1938，35：83－85.

［9］Horovitz S，Jim nez H.Cruzamientos interespecificos e intergenericos en caricaceas y sus implicaciones fitotechicas［J］.Agron Trop，1967，17：323－343.

［10］Liu Z Y，Moore P H，Ma H，et al.A primitive Y chromosome in papaya marks incipient sex chromosome evolution［J］.Nature，2004，427：348－352.

［11］Urasaki N，Tokumoto M，Tarora K，et al.A male and hermaphrodite specific RAPD marker for papaya（Carica papayaL）［J］.Theor Appl Genet，2002，104（2／3）：281－285.

［12］華南農業(yè)大學.果樹栽培學各論［M］.北京：中國農業(yè)出版社，1989：243.