液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬尿中9種β－受體激動劑殘留

黃艷梅 黃卓煥 馮榮華 李東霞 賴衛(wèi)華

（1.南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，江西 南昌 330077）

β－受體激動劑俗稱“瘦肉精”，屬于苯乙胺類藥物（PEAs）［1］，因能與動物機體內(nèi)絕大多數(shù)組織細胞膜上的β受體結(jié)合而得名，因能夠調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮、松弛氣管平滑肌及促使體內(nèi)營養(yǎng)素重新分配，有一定的藥用價值，常作為治療哮喘的藥物［2］。另外，因β－受體激動劑具有使能量再分配、減少脂肪沉積、增加酮體瘦肉率、以及促進動物生長的作用，使得近年來β－受體激動劑濫用于畜產(chǎn)品養(yǎng)殖中。若人類攝入量過大，會出現(xiàn)毒副作用，如肌肉振顫、心慌、戰(zhàn)栗、頭疼、惡心、嘔吐等不良反應癥狀，特別是對高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，嚴重的可導致死亡［3］。為了防止β－受體激動進入人類的食物鏈，歐盟頒布規(guī)定禁止在畜牧生產(chǎn)中使用該類藥物作為生長促進劑［4］。中國農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國家藥品監(jiān)督管理局聯(lián)合于2002年發(fā)布《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》，將部分β－受體激動劑列入其中［5］。

目前檢測β－受體激動劑的方法主要有兩種：① 快速篩查技術(shù)：主要有酶聯(lián)免疫技術(shù)［6－8］和免疫層析技術(shù)［9］，前者檢驗特異性強、試驗結(jié)果較為準確、試驗重復性強；后者操作簡單且可現(xiàn)場快速檢測?？焖俸Y查法一般只用于β－受體激動劑半定量或定性檢測，且多殘留定量分析受限，檢測結(jié)果可能會出現(xiàn)假陽性。因此，必須通過儀器確證后方能作為監(jiān)管部門的執(zhí)法依據(jù)。② 確證分析技術(shù)，包括氣相色譜－串聯(lián) 質(zhì)譜法［10］和 液 相 色 譜 － 串 聯(lián) 質(zhì) 譜 法［1，11，12］。色 譜 － 串 聯(lián)質(zhì)譜法，可同時對多種β－受體激動劑定性，檢測結(jié)果精確、靈敏度高，結(jié)果可靠且為國際所公認的執(zhí)法依據(jù)［4］。

檢測動物組織或代謝物中β－受體激動劑的多殘留，對食品安全的評價及監(jiān)控具有重要的意義。β－受體激動劑經(jīng)動物體內(nèi)代謝后主要以原尿及其代謝物形式排出，檢測動物尿液中β－受體激動劑多殘留的含量顯得更直接、方便、全面，可實現(xiàn)宰前檢測。中國農(nóng)業(yè)部1025號公告－11－2008［13］規(guī)定了豬尿中西馬特羅、沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺4種β－受體激動劑單個或混合物殘留量的液質(zhì)檢測方法，但β－受體激動劑的種類繁多、性質(zhì)差異較大，若只以檢測少數(shù)幾種興奮劑作為尿檢的指標，不能全面地分析該原料是否受到β－受體激動劑的污染或有違法添加。

本試驗參照中國農(nóng)業(yè)部1025號公告－11－2008前處理方法，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜，在正離子多反應監(jiān)測模式下，測定經(jīng)鹽酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶酶解，異丙醇－乙酸乙酯液液萃取，MCX柱子固相萃取后試樣中的9種β－受體激動劑（包括特布他林、沙丁胺醇、西馬特羅、非諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅、噴布特羅）。制備一系列β－受體激動劑濃度的豬尿樣本，通過其平均回收率、相對標準偏差、相關(guān)系數(shù)等參數(shù)初步評估“公告”前處理方法結(jié)合選取的液相和質(zhì)譜測定條件，增加檢測項目的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

特布他林、沙丁胺醇、西馬特羅、非諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅、噴布特羅標準品：美國Sigma公司；

β－鹽酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶、沙丁胺醇D3、萊克多巴胺D3、克倫特羅D9內(nèi)標物：美國Sigma公司；

甲醇、甲酸：色譜純，美國Tedia公司；

乙酸銨、氫氧化鈉、氨水：分析純，天津大茂試劑廠；

異丙醇、乙酸乙酯：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 設(shè)備

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent1260／6410A型，美國安捷倫公司；

恒溫水浴振蕩器：SHA－C型，常州國華電器有限公司；

渦旋振蕩器：Vortex genie2型，美國Scientific Industries公司；

高速離心機：H－2050R型，湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；

pH計：PHS－3B型，上海虹益儀器儀表有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE52－98型，上海亞榮生化儀器廠；

固相萃取柱：MCX型，美國Waters公司；

氮吹儀：TTL－DCⅡ型，上海深瑞儀器有限公司；

濾膜：4.5μm，美國 Millipore公司。

1.2 前處理方法

1.2.1 酶解 準確量取5mL豬尿試樣，于50mL離心管中，依次加入5mL 0.2mol／mL的乙酸銨緩液、40μLβ－鹽酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶，混勻，37℃，避光振蕩16h。

1.2.2 提取 樣本酶解16h后，添加100μL 100ng／mL的同位素內(nèi)標，渦旋混勻，高速離心（10 000r／min，10min），轉(zhuǎn)移上清液于另一50mL離心管中，用5mol／mL的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)上清液的pH至9.8±0.2。調(diào)節(jié)完pH值后，依次加入10mL異丙醇－乙酸乙酯和2mL的飽和氯化鈉溶液，渦旋振蕩5min，5 000r／min離心10min。轉(zhuǎn)移上清液至另一50mL離心管后，樣品進行添加異丙醇－乙酸乙酯、飽和氯化鈉溶液的2次提取。將兩次得到的上清液合并在同一個離心管中，50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至殘留少許液體時，添加1mL乙醇，再旋轉(zhuǎn)至干。最后用5mL的乙酸銨緩沖液溶解殘渣，備用。

1.2.3 凈化 依次用3mL甲醇、3mL水活化 MCX柱，備用液過柱，用3mL水、3mL 2%的甲酸水溶液、3mL甲醇依次淋洗MCX柱。再用5mL 5%的氨水甲醇溶液洗脫MCX柱于15mL的離心管中。洗脫液在50℃條件下，氮氣吹干。殘渣用0.5mL的甲醇－0.1%甲酸／水溶解，濾膜過濾，定容于1mL的進樣瓶中。液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀備用。

1.2.4 繪制校正曲線 準確量取適量特布他林、沙丁胺醇、西馬特羅、非諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅、噴布特羅混合標準液，制備1，2，4，10，20ng／mL的一系列溶液（內(nèi)標物均為10ng）。峰面積與對應濃度進行線性回歸，并繪制校準曲線。

1.3 儀器測定條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse plus C18（2.1mm×150mm 3.5μm）；流動相：A 相：0.1%甲酸甲醇溶液；B相：0.1%甲酸／0.5%甲醇水溶液；梯度洗脫：0～5min，5%A線性變化至60%；5～10min，60%A線性變化至95%A；10.00～10.01min，95%A變化至5%A；10.01～18.00min，保持5%A；流速：0.3mL／min；進樣量：5μL；柱溫：35℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測；電噴霧電壓：4.0kV；離子源溫度：300℃；干燥氣流速：7L／min；霧化氣壓力：310.3kPa；其它參數(shù)：見表1。

1.4 結(jié)果判定

以保留時間，陽性樣品定性離子與定量離子相對豐度比值和標準品的離子相對豐度比值的比值在80%～120%為定性依據(jù)。由于缺少適合非諾特羅和噴布特羅的內(nèi)標物，二者皆以外標法定量。西馬特羅、特布他林、沙丁胺醇以沙丁胺醇D3為內(nèi)標物，萊克多巴胺以萊克多巴胺D3為內(nèi)標物，氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅以克倫特羅D9為內(nèi)標物，采用內(nèi)標法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準品離子色譜圖

在選定的測定條件下，添加量為1ng／mL的混標溶液的總離子流色譜圖見圖1。

在MRM模式，分別對9種β－受體激動劑特征離子對進行監(jiān)控，得到其添加量為1ng／mL時相應的出峰時間和響應值，見表2。

表1 9種β－受體激動劑的監(jiān)測離子對、裂解電壓和碰撞能量Table 1 Monitoring ion pairs，cracking voltage and collision energy of 9β－agonists

圖1 總離子流色譜圖（1ng／mL）Figure 1 Total ion chromatogram of sample（1ng／mL）

表2 9種β－受體激動劑的出峰時間和響應值Table 2 Appearance times and response values of nineβ－agonists

2.2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)與檢測限

9種β－受體激動劑線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)與檢測限見表3。

表3 9種β－受體激動劑線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)與檢測限Table 3 Regression equations，correlation coefficients and LODs for nineβ－agonists

在選定的液相色譜、質(zhì)譜測定條件下，檢測添加量范圍為1～20ng／mL的西馬特羅、特布他林、沙丁胺醇、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅，以目標化合物與內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標，目標化合物與內(nèi)標物的濃度比之為橫坐標，進行線性回歸。在相同的條件下，檢測相同濃度范圍的非諾特羅和噴布特羅，其濃度與峰面積進行線性回歸。采用該方法獲得的標準曲線線性良好，在1～20ng／mL的濃度范圍內(nèi)，9種β－受體激動劑的標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.997。因此，該方法具有較大的線性范圍和良好的線性相關(guān)性。選擇9種β－受體激動劑添加量為1ng／mL，待測化合物的響應值的信噪比折算為3倍信噪比時，樣品中9種β－受體激動劑的檢測限在之間，結(jié)果表明，該方法檢測靈敏度高，可保證試驗結(jié)果的準確性。

2.3 平均回收率與RSD

選取空白試樣，添加水平為1，2，4，10，20ng／mL時，9種β－受體激動劑的平均回收率 （n ＝4）在82.12%～118.61%，相對標準偏為0.97%～11.53%，具體結(jié)果見表4。該方法準確度和精密度可滿足9種β－受體激動劑的檢測要求。

表4 9種β－受體激動劑平均回收率Table 4 Recoveries of nineβ－agonists（n ＝4）

續(xù)表4

3 結(jié)論

本試驗參照常規(guī)的前處理方法，采用新的檢測條件，以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對豬尿樣本中9種β－受體激動劑實行了同時檢測。結(jié)果顯示，在添加量為1～20ng／mL范圍內(nèi)，回收率為88.31%～118.61%，相對標準偏差為0.97%～11.53%，儀器檢測限在0.01～0.12ng／mL。該方法具有線性范圍廣，回收率高，精度好，靈敏度高的特點，較之中國農(nóng)業(yè)部1025號公告，其可增加β－受體激動劑可檢項目。該法能滿足現(xiàn)有檢測要求，為興奮劑的市場監(jiān)控提供了有效的檢測手段。

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