蛋白酶水解馬氏珠母貝肉對鎘解離效果的研究

蒲利民 吳曉萍 王 濤 毛偉杰

（1.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；3.國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東 湛江 524088；4.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

鎘是一種對人類健康有害的有毒重金屬［1，2］。隨著中國工業(yè)化的快速發(fā)展，大量的重金屬以多種方式進(jìn)入海洋，由此造成水環(huán)境中的重金屬鎘的含量不斷增加［3－5］。雙殼貝類屬于濾食性生物，在濾食餌料生物的同時(shí)，容易將水中有害物質(zhì)吸入體內(nèi)，研究［6，7］表明，貝類對鎘的富集系數(shù)可高達(dá)105～106，很多地區(qū)的貝類鎘的含量嚴(yán)重超標(biāo)。

馬氏珠母貝 （Pinctada martensii）是生產(chǎn)珍珠的主要母貝，也是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)源［8］，采珠后除可做飼料等外，還可以進(jìn)行深加工，制備諸如貝肉罐頭、蛋白質(zhì)營養(yǎng)液等營養(yǎng)品以及提取功能活性成分如糖胺聚糖等以提高利用率和附加值［9］。但馬氏珠母貝的重金屬鎘的含量很高，且在貝肉的深加工產(chǎn)品中由于濃縮等工藝會導(dǎo)致鎘的含量進(jìn)一步增大［10］。馬氏珠母貝體內(nèi)過量的鎘嚴(yán)重影響了它的食用安全性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此探索有效的去除其體內(nèi)鎘的方法具有重要意義。研究［11］表明，貝類中的鎘主要與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合，若想去除貝類中鎘，需先將鎘從蛋白質(zhì)等大分子中解離出來。

本試驗(yàn)針對馬氏珠母貝肉中鎘含量超標(biāo)等問題，利用蛋白酶對馬氏珠母貝肉水解，探討水解條件對鎘的解離效果，優(yōu)選出適用于馬氏珠母貝肉水解的蛋白酶；分別進(jìn)行單一酶解試驗(yàn)和復(fù)合酶解試驗(yàn)，并優(yōu)化條件，比較不同酶解技術(shù)對馬氏貝肉中鎘的解離效果；采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案，建立動態(tài)數(shù)學(xué)模型，優(yōu)選出對馬氏珠母貝肉具有良好水解效果和鎘解離效果的蛋白酶及其酶解參數(shù)。為下一步貝類鎘的脫除奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

馬氏珠母貝：購于湛江市徐聞縣流沙灣珍珠養(yǎng)殖場，將貝去殼取其全臟器用超純水洗凈，瀝干后勻漿，－18℃凍藏備用；

木瓜蛋白酶：3 500U／mg，廣西南寧市龐博生物工程有限公司；

胰蛋白酶：250U／mg，美國Sigma公司；

中性蛋白酶：6萬U／mg，美國Sigma公司；

枯草桿菌蛋白酶：4 000U／mg，廣西南寧市龐博生物工程有限公司；

胃蛋白酶：3 000U／mg，美國Sigma公司。

甲醛、鹽酸、硝酸、硫酸、高氯酸：優(yōu)級純，廣州化學(xué)試劑二廠；

氫氧化鈉：分析純，廣州化學(xué)試劑二廠；

鎘標(biāo)準(zhǔn)GBW08612（1.0mg）：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；

試驗(yàn)用水：超純水，本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋：HHS型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；

pH酸度計(jì)：PHSJ－4A型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：JB－2型，常州國華電器有限公司；

臺式離心機(jī)：TD5型，長沙英泰儀器有限公司；

原子吸收光譜儀：Z－5000型，日本日立公司；

超純水系統(tǒng)：Milli－Q Academic A10型，美國 Millipore

公司。

1.2 方法

1.2.1 總氮、氨基態(tài)氮和鎘含量的測定

（1）總氮含量的測定：采用凱氏定氮法［12］。

（2）氨基態(tài)氮含量的測定：采用甲醛滴定法［13］。

（3）鎘含量的測定：采用石墨爐原子吸收光譜法［14］。

1.2.2 蛋白酶篩選 選用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、精制中性蛋白酶、胃蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶5種蛋白酶對馬氏珠母貝肉進(jìn)行酶解試驗(yàn)，以鎘解離度為指標(biāo)，比較5種蛋白酶水解馬氏珠母貝肉對鎘解離度影響的大小。分別在液固比4∶1（V∶m），加酶量4 500U／g，水解時(shí)間5h，最適溫度和最適pH條件下，進(jìn)行水解，測定水解液的鎘含量，按式（1）計(jì)算鎘的解離度。

1.2.3 單一酶水解貝肉蛋白質(zhì) 根據(jù)1.2.2篩選出的枯草桿菌蛋白酶做單一酶解試驗(yàn)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對水解條件進(jìn)行優(yōu)化。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解溫度、pH值、加酶量、液固比和水解時(shí)間為考查對象，以馬氏珠母貝肉水解液的鎘解離度為響應(yīng)指標(biāo)，利用中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）方法進(jìn)行編碼及響應(yīng)面試驗(yàn)，Design－Expert 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以獲得枯草桿菌蛋白酶對馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解的最佳水解參數(shù)。

1.2.4 雙酶復(fù)合水解貝肉蛋白質(zhì)

（1）復(fù)合酶組合比例的選擇：按酶活比例分別為4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4將枯草桿菌蛋白酶和胰蛋白酶混合。用復(fù)合酶對馬氏珠母貝肉進(jìn)行酶解，酶解條件為液固比3∶1（V∶m），水解溫度50℃，水解時(shí)間6h，加酶量為4 500U／g，pH 7.5。計(jì)算鎘解離度（因?yàn)橹饕芯繉︽k解離度的影響，因而選擇鎘解離度為指標(biāo)，篩選復(fù)合酶及其比例），同時(shí)以枯草桿菌蛋白酶和胰蛋白酶的單一酶解試驗(yàn)結(jié)果作為對照，選擇鎘解離度最大的組合比例為復(fù)合酶最佳組合比例。

（2）響應(yīng)面法優(yōu)化雙酶復(fù)合水解條件：以水解溫度、加酶量和水解時(shí)間為試驗(yàn)因素，以鎘解離度和水解得率為響應(yīng)指標(biāo)，利用中心組合設(shè)計(jì)方法進(jìn)行編碼及響應(yīng)面試驗(yàn)，研究各因素對鎘解離度和水解得率的影響，通過模型計(jì)算得到雙酶復(fù)合水解馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)的最佳酶解參數(shù)，按式（2）計(jì)算鎘水解得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

不同蛋白酶對馬氏珠母貝肉的水解效果見表1。由表1可知，枯草桿菌蛋白酶的鎘解離度最高，解離效果最好，是胰蛋白酶次之，因此選擇枯草桿菌蛋白酶為馬氏珠母貝肉酶法解離鎘的最適蛋白酶。

2.2 枯草桿菌蛋白酶水解貝肉對鎘解離度的影響

2.2.1 試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒑头讲罘治?由2.1蛋白酶篩選的結(jié)果可知，枯草桿菌蛋白酶最適于解離馬氏珠母貝肉中的鎘，因此對其進(jìn)一步進(jìn)行條件優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以貝肉水解液的鎘解離率為試驗(yàn)指標(biāo)，設(shè)計(jì)5因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平表見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3。

表1 不同蛋白酶對馬氏珠母貝肉的水解效果Table 1 Hydrolysates of Pinctada martensii meat by different protease

表2 枯草桿菌蛋白酶單一水解試驗(yàn)因素和水平表Table 2 Factors and levels central composite design hydrolysis by subtilisin

表3 枯草桿菌蛋白酶單一水解試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果?Table 3 Central composite design and results of hydrolysis by subtilisin

續(xù)表3

用Design－Expert軟件以響應(yīng)面法中心組合設(shè)計(jì)原理建立酶解試驗(yàn)方案，并進(jìn)行試驗(yàn)，在因素方差分析中，剔除AB、AE、A2等不顯著的交互因素，得到5因素與鎘解離度 （Y）之間的回歸模型：Y ＝66.16＋4.23A＋4.82B＋4.35C＋9.93 D－4.81E－3.48AD－4.32CD－4.91B2－4.89C2－9.77E2，剔除不顯著交互因素的方差檢驗(yàn)見表4。

表4 因素方差分析Table 4 Variance analysis of factors

圖1 液固比和時(shí)間交互作用影響鎘解離度的曲面圖和等高線圖Figure 1 Response surface plot and contour plot of the effects of Liquid to solid ratio and time on the taxol production

由表4可知，失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.153 6＞0.05），回歸方程極顯著（P＜0.000 1），說明模型擬合良好。模型的相關(guān)系數(shù)R2＝91.76%＞90%，說明模型具有良好的相關(guān)性。變異系數(shù)（CV）反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高，此模型的變異系數(shù)（CV）為2.405%，說明此模型能較好的反應(yīng)真實(shí)的試驗(yàn)值。

2.2.2 響應(yīng)面交互因素作用分析和優(yōu)化 圖1、圖2分別顯示液固比和溫度交互作用、添加量和液固比交互作用對鎘解離度影響的趨勢圖，從等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互的顯著程度，圓形表示交互作用不顯著，橢圓表示顯著，圖1和圖2等高線呈現(xiàn)橢圓型，表明兩個(gè)圖對應(yīng)的交互作用均顯著。

由圖1、圖2的響應(yīng)面立體圖可以看出，響應(yīng)值存在最大值。通過軟件分析計(jì)算，可以得到鎘解離度的最大預(yù)測值為82.843 7%，水解參數(shù)條件為時(shí)間4.83h，溫度64.87，添加量4 680U／g，液固比5∶1（V∶m），pH值7.56。

考慮到實(shí)際操作的方便，將水解條件修正為時(shí)間5h，溫度65℃，添加量4 700U／g，液固比5∶1（V∶m），pH 值7.5。在修正條件下對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測得鎘解離度81.869%，與預(yù)測值（82.8437%）基本吻合，表明模型是合理有效的，解離效果較優(yōu)。

圖2 添加量和液固比交互作用影響鎘解離度的曲面圖和等高線圖Figure 2 Response surface plot and contour plot of the effects of amount of protease add and solid－liquid ratioon the taxol production

2.3 雙酶復(fù)合水解貝肉對鎘解離度的影響

2.3.1 復(fù)合酶組合比例確定 由表5可知，在胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的酶活力比為3∶1時(shí)，水解得率、鎘解離度均較優(yōu)。因此選擇胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶組合比例為3∶1的復(fù)合酶進(jìn)行復(fù)合酶解試驗(yàn)。

表5 復(fù)合酶組合的水解試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Complex enzyme hydrolysis of the combination of results

2.3.2 響應(yīng)面（CCD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化因素的最佳水平 以水解溫度、加酶量和水解時(shí)間為影響因素，鎘解離度和水解得率為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)（CCD）原理，得到3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，因素水平見表6，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果見表7。

表6 胰－枯復(fù)合酶水解試驗(yàn)因素和水平表Table 6 Factors and levels central composite design hydrolysis by mixed enzymes

復(fù)合酶和10g馬氏珠母貝肉在pH值7.0，液固比4∶1（V∶m）下進(jìn)行酶解試驗(yàn)，得到3因素與鎘解離度（Y）和水解得率（Z）之間的回歸模型：Y＝84.71＋7.77A＋11.85B＋6.32C－1.84AB＋13.64AC＋0.63BC－9.71A2－11.06B2－16.78C2，Z＝86.12＋1.60A－3.06B＋2.19C＋0.13AB－0.82AC－1.05BC＋0.89A2－4.69B2－0.58C2，對回歸模型進(jìn)行方差分析，回歸模型的方差檢驗(yàn)詳見表8和9。

由表8可知，鎘解離度的回歸模型極顯著（P＝0.000 5＜0.01），同時(shí)模型中的時(shí)間、溫度、添加量和時(shí)間與添加量的交互項(xiàng)，以及時(shí)間、溫度、添加量顯著（P＜0.05）。鎘解離度回歸模型的方差分析失擬項(xiàng)不顯著 （P＝0.258＞0.05），說明此模型擬合程度較好。變異系數(shù)（CV）反映模型的置信度.CV值越低模型的置信度越高，此模型的變異系數(shù)（CV）為2.87%，說明此模型能較好地反應(yīng)真實(shí)的試驗(yàn)值。相關(guān)系數(shù)R2＝94.2%＞90%，說明模型的相關(guān)性好。因此試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢杂行M預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。

表7 復(fù)合酶解試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果?Table 7 Central composite design and results of enzymatic hydrolysis

表8 鎘解離度的回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of factors Cd

表9 水解得率的方差分析Table 9 Variance analysis of hydrolysis yield

由表9可知，水解得率二次回歸模型極顯著（P＝0.001 1＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.287 7＞0.05），說明此模型擬合程度較好。同時(shí)模型中時(shí)間、溫度、添加量、溫度的二次項(xiàng)均顯著（P＜0.05）。相關(guān)系數(shù)R2＝94.72%，模型的相關(guān)性良好；此模型的變異系數(shù)（CV）為1.64%，說明此模型能較好的反應(yīng)真實(shí)的試驗(yàn)值。因此試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢杂行M預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。

因此，模型是顯著的。剔除不顯著因素的影響后，得到3因素與鎘的解離度（Y）和水解得率（Z）之間的回歸模型：Y ＝84.71＋7.77A ＋11.85B ＋6.32C ＋13.64AC －9.71A2－11.06B2－16.78C2，Z＝86.26＋1.60A－3.06B＋2.19C－4.67B2。

2.3.3 響應(yīng)面交互因素作用分析和優(yōu)化 由表8和表9方差分析得知，只有時(shí)間和添加量的交互因素對鎘解離度的影響是顯著的，因此只分析此交互因素的影響。

圖3中等高線呈現(xiàn)橢圓形，表示添加量與時(shí)間的交互作用是顯著的；立體圖可以看出，響應(yīng)值存在最大值。通過軟件分析計(jì)算預(yù)測最佳的酶解條件是時(shí)間5h，溫度50.04℃，添加量5 687.53U／g，最佳鎘解離度能達(dá)到87.685 3%，酶解得率達(dá)到89.692 8%。根據(jù)實(shí)際情況修正為時(shí)間5h，溫度50℃，添加量5 700U／g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)效果良好，鎘解離度為85.523%，水解得率為90.93%和預(yù)測結(jié)果（89.6928%）接近。

圖3 時(shí)間與添加量的交互因素影響鎘解離度的曲面圖和等高線圖Figure 3 Response surface plot and contour plot of the effects of time and solid－liquid ratio on the taxol production

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了單一酶解、復(fù)合酶解對貝肉中鎘的解離影響，以鎘解離度和水解得率為響應(yīng)指標(biāo)，利用響應(yīng)面試驗(yàn)法確定了雙酶復(fù)合水解馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)最佳酶解條件：枯草桿菌蛋白酶與胰蛋白酶以活力比為3∶1，酶添加量5 700U／g，液固比4∶1（V∶m），pH 值7.0，溫度50℃，酶解時(shí)間5h，在此條件下水解得率為90.93%，鎘解離度達(dá)到85.52%。研究結(jié)果表明試驗(yàn)中應(yīng)用的蛋白酶均對貝肉中的鎘有解離的作用，其中枯草桿菌蛋白酶的鎘解離度最高，而復(fù)合酶解較單一酶酶解效果更好。

之前本課題組已經(jīng)報(bào)告了有機(jī)酸在一定條件下對牡蠣勻漿液中的重金屬鎘具有絡(luò)合提取的作用［14］，檸檬酸對馬氏珠母貝勻漿液中鎘的提取率達(dá)到92.2%［15］，但水解得率并不高，如馬氏珠母貝肉的總氨基酸含量為13.12g／100g，檸檬酸提取液的總氨基酸含量為2.94g／100g，提取液中總氨基酸含量僅占原貝肉中的22.4%。本次報(bào)告的酶法對鎘的解離度略低于檸檬酸提取法，但其蛋白質(zhì)水解得率較高，提示酶解液中氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的利用價(jià)值要優(yōu)于檸檬酸提取液的。用酶解法或有機(jī)酸法提取重金屬鎘之后，提取液中重金屬鎘的脫除及脫鎘后提取液中營養(yǎng)成分的再利用有深入研究的必要。

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