一株高效降解菲的植物內(nèi)生細(xì)菌篩選及其生長(zhǎng)特性

劉 爽,劉 娟,凌婉婷,朱雪竹,高彥征 (南京農(nóng)業(yè)大學(xué),土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所,江蘇 南京 210095)

多環(huán)芳烴(PAHs)是由2個(gè)或2個(gè)以上苯環(huán)組成的土壤環(huán)境中常見的一類重要持久性有機(jī)污染物,其疏水性強(qiáng)、難于降解[1].作為疏水性有機(jī)污染物,土壤中 PAHs可被植物吸收并在體內(nèi)積累[2].如何降低植物 PAHs污染的風(fēng)險(xiǎn)是當(dāng)前農(nóng)業(yè)環(huán)境領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一.

植物內(nèi)生細(xì)菌是指能夠定殖在植物健康組織間隙或細(xì)胞內(nèi)、并與宿主植物建立和諧共生關(guān)系的一類微生物[3],可促進(jìn)植物生長(zhǎng),增強(qiáng)宿主植物抗逆性、抗病蟲害等作用,并可作為生防菌和外源基因的重要載體[4-5].研究表明,植物內(nèi)生菌可影響植物吸收重金屬.Sun等[6]從銅礦區(qū)油菜體內(nèi)篩選出內(nèi)生細(xì)菌JL35、YM22、YM23,浸染后蕓苔地上部銅含量提高了 63%～125%.Sheng等[7]分離了 2株植物內(nèi)生細(xì)菌,可提高植株對(duì)鉛的吸收.然而遺憾的是,關(guān)于植物內(nèi)生菌影響植物吸收有機(jī)污染物的報(bào)道仍很少.Ho等[8]指出內(nèi)生細(xì)菌Achromobacter xylosoxidansF3B可以提高多環(huán)芳烴污染土壤上植株的根長(zhǎng)和生物量,增強(qiáng)植株對(duì)PAHs的耐受性.Barac等[9]將利用基因改造過的內(nèi)生細(xì)菌B.cepaciaL.S.2.4浸染黃色羽扇豆,發(fā)現(xiàn)通過植物葉片揮發(fā)的甲苯量減少 50%～70%.有學(xué)者推測(cè)篩選具有降解特性的植物功能內(nèi)生菌、并將其定殖在目標(biāo)植物上,有望提高植物對(duì)有機(jī)污染物的降解作用[10-11].然而,針對(duì)PAHs等持久性有機(jī)污染物,能否利用內(nèi)生細(xì)菌來降解植物體內(nèi)污染物,進(jìn)而減低作物污染的風(fēng)險(xiǎn),國(guó)內(nèi)外仍少有資料報(bào)道.

本研究從長(zhǎng)期受PAHs污染的植物看麥娘中,篩選出一株高效降解菲的菌株 Pn2,研究了不同條件下菌株P(guān)n2生長(zhǎng)特性及其對(duì)菲的降解作用.研究結(jié)果一方面可豐富植物內(nèi)生細(xì)菌菌種庫(kù),另一方面也可為進(jìn)一步研究植物PAHs污染的內(nèi)生細(xì)菌調(diào)控技術(shù)、減低植物污染風(fēng)險(xiǎn)、保障農(nóng)產(chǎn)品安全等提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM):NaCl 1.00g/L,NH4NO31.00g/L, K2HPO41.50g/L, KH2PO40.50g/L, MgSO4·7H2O 0.10g/L, FeSO40.025g/L,蒸餾水 1000mL,pH 7.0.菲降解菌篩選培養(yǎng)基:MSM中加入一定量的菲丙酮溶液(丙酮＜1‰),配制到所需濃度.1/10LB培養(yǎng)基:酵母膏0.50g/L,蛋白胨1.00g/L,NaCl 1.00g/L ,蒸餾水1000mL.固體培養(yǎng)基加 1.5%的瓊脂.上述培養(yǎng)基于 121℃下蒸汽滅菌20min.

菲(PHE,純度＞98%)購(gòu)自 Aldrich Chemical Co.甲醇為色譜醇,其他試劑為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物內(nèi)生細(xì)菌分離 將采自南京江寧揚(yáng)子石化芳烴廠排污口的新鮮看麥娘植株表面消毒: 植物用自來水沖洗干凈后,超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精漂洗 3～5min,無菌水沖洗 3～4次,0.1%HgCl2溶液漂洗2～5min,無菌水再?zèng)_洗數(shù)次.將經(jīng)表面消毒的植物樣品移入LB固體平板上、28℃培養(yǎng) 24h后,檢查平板上是否有細(xì)菌生長(zhǎng).將經(jīng)檢驗(yàn)消毒完全的植株移入無菌研缽,用滅菌剪刀剪碎后,加無菌水充分研磨,取上清液梯度稀釋涂布于100mg/L菲降解固體培養(yǎng)基平板上,28℃培養(yǎng) 3d、待菌落長(zhǎng)出,利用平板劃線分離純化出菌株.

1.2.2 具有菲降解特性的植物內(nèi)生細(xì)菌篩選 挑取單菌落劃線于1000mg/L菲降解菌篩選固體培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng) 3d,觀察菌株能否生長(zhǎng).挑選能在菲篩選固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行菲降解實(shí)驗(yàn).

1.2.3 菌懸液制備 單個(gè)菌落接種于1/10LB培養(yǎng)基中,于搖床 30℃和 150r/min下振蕩培養(yǎng)18h,10000r/min離心 3min,棄盡上清液,用 MSM培養(yǎng)基清洗菌體2次后,MSM培養(yǎng)基重新懸浮菌體細(xì)胞,調(diào)整菌體濃度到OD600=1.

1.2.4 液體培養(yǎng)條件下菌株 Pn2對(duì)菲的降解向無菌三角瓶中加入一定量的菲丙酮溶液,待丙酮完全揮發(fā)后加入20mL MSM培養(yǎng)基,測(cè)得反應(yīng)瓶中菲的濃度為49.92mg/L,以5%的接種量加入菌懸液,于搖床上 30℃和 150r/min下振蕩培養(yǎng),每隔6h整瓶取樣,3個(gè)重復(fù).測(cè)定培養(yǎng)液中菲濃度和細(xì)菌數(shù)量.

1.2.5 污染強(qiáng)度對(duì) Pn2降解性能的影響 向MSM 培養(yǎng)基中加入菲丙酮溶液,瓶中菲濃度分別為 50,100,150,200,250mg/L,以 5%的接種量加入菌懸液,30℃和150r/min下振蕩培養(yǎng),每隔24h整瓶取樣,測(cè)定培養(yǎng)液中菲濃度.

1.2.6 接種量對(duì)Pn2降解性能的影響 向MSM培養(yǎng)基中加入菲丙酮溶液,瓶中菲濃度為50mg/L,分別以5%、10%、15%的接種量加入菌懸液,30℃和150r/min下振蕩培養(yǎng),每隔12h整瓶取樣,測(cè)定培養(yǎng)液菲濃度.

1.2.7 菌株鑒定 利用菌體形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)并結(jié)合16Sr DNA序列同源性分析對(duì)菌株P(guān)n2進(jìn)行鑒定,確定其分類地位.菌株生理生化特性測(cè)定參照文獻(xiàn)[12].采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌株P(guān)n2的DNA,并利用PCR擴(kuò)增其16S rDNA,擴(kuò)增產(chǎn)物送于南京金思瑞科技有限公司測(cè)序,所獲測(cè)序結(jié)果在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中與相關(guān)的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析.

1.2.8 菌株P(guān)n2生長(zhǎng)特性 研究了溫度、pH值、鹽濃度、通氣量對(duì)Pn2生長(zhǎng)的影響.以5%接種量向1/10LB液體培養(yǎng)基中加入菌懸液,分別在不同溫度的搖床上 150r/min下振蕩培養(yǎng) 18h,測(cè)定菌液OD600值.以5%接種量分別接種菌株P(guān)n2于不同 pH值、不同鹽濃度、不同裝液量的 1/10LB液體培養(yǎng)基中,30℃和 150r/min下振蕩培養(yǎng) 18h后測(cè)定菌液OD600值.研究了菌株P(guān)n2的抗性.將菌株點(diǎn)接于不同濃度的抗生素平板,于30℃恒溫下培養(yǎng)24h,觀察其生長(zhǎng)情況.

1.3 分析方法

1.3.1 培養(yǎng)液中菲濃度測(cè)定 整瓶取樣,加入等體積的甲醇,超聲 30min,使瓶中菲全部溶解,過0.22μm 的濾膜,用高效液相色譜儀(HPLC)測(cè)定.HPLC檢測(cè)儀器及條件:島津 LC-20AT高效液相色譜儀(檢測(cè)器型號(hào) SPD-20A),色譜柱為4.6×150mm 烷基 C18反相柱,柱溫 40℃,流動(dòng)相為甲醇:水(9:1)、流速為0.9mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm,進(jìn)樣量 10μL.此方法菲的回收率為 101.69%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.65%(n=6).

1.3.2 OD值測(cè)定 使用 UVmini-1240紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD值,檢測(cè)波長(zhǎng)為600nm.

1.3.3 細(xì)菌數(shù)量測(cè)定 采用平板稀釋涂布法測(cè)定培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)量,平板為菲降解菌篩選固體平板.

2 結(jié)果與分析

2.1 降解作用

菌株 Pn2對(duì)菲的降解動(dòng)力學(xué)曲線如圖 1(a)所示.接種后 72h內(nèi),菌株 Pn2可將菲從49.92mg/L降解到0.61mg/L,降解率為98.78%.接種后的前 12h,菌株處于環(huán)境適應(yīng)期,菲降解率只有 8.05%.接種 12h后,進(jìn)入菲快速降解階段.42h后,菲降解率＞90%,且基本保持不變,這說明菲已基本被降解.

菌株P(guān)n2在接種后的12h內(nèi)處于生長(zhǎng)遲緩期,12h以后菌株 Pn2能利用唯一碳源菲快速生長(zhǎng),在30h后,由于菲碳源的減少,菌株P(guān)n2生長(zhǎng)速度減慢.72h內(nèi),細(xì)菌數(shù)量由1.88×108CFU/mL上升到 8.87×108CFU/mL.

接種12h后,培養(yǎng)液顏色發(fā)生了變化,由無色漸變成橙黃色.陶雪琴等[13]也發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象,這一現(xiàn)象應(yīng)該是由于中間代謝產(chǎn)物引起的,需要進(jìn)一步做代謝途徑以確認(rèn)橙黃色物質(zhì).

對(duì)菲濃度隨時(shí)間的變化進(jìn)行擬合,建立了Monod模型[14],推導(dǎo)后得到動(dòng)力學(xué)方程式:

式中:c為菲濃度,mg/L;t為反應(yīng)時(shí)間;K為動(dòng)力學(xué)常數(shù).菲的降解反應(yīng)顯著地符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)特征,擬合結(jié)果見圖1(b).

圖1 菌株P(guān)n2對(duì)菲的降解動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Degradation kinetic curve of phenanthrene by strain Pn2

接種12～24h內(nèi),接種量顯著影響了菲降解率,如圖2所示.接種12h時(shí),接種量為10%和15%處理的菲降解率分別為38.01%和32.84%,而5%的接種量處理的菲降解率僅13%;表明,高接種量顯著提高了菲降解率;24h時(shí),菌株接種量對(duì)菲降解率仍有顯著影響,且表現(xiàn)為接種量越大、菲降解率越高.36h和48h時(shí),3種不同接種量對(duì)菲降解率的影響無顯著性差異,這主要是因?yàn)樘荚捶撇蛔?菌株P(guān)n2沒有足夠的碳源利用.

圖2 接種量對(duì)菌株P(guān)n2降解菲的影響Fig.2 Effect of inoculation amounts of Pn2 on phenanthrene degradation

污染強(qiáng)度對(duì)菌株 Pn2降解菲的影響見圖 3.接種 1d后,隨污染強(qiáng)度升高,菲降解率先增大后減小.這主要是由于 PAHs濃度低時(shí)不能快速誘導(dǎo)產(chǎn)生裂解酶[15],濃度太高則對(duì)微生物有毒副作用,限制PAHs的微生物降解.從資料來看,給定細(xì)菌濃度下,化合物存在一個(gè)能夠被有效降解的最適濃度[16].當(dāng)菲污染強(qiáng)度為150mg/L時(shí),菲降解率最大,說明供試條件下菲的最有效降解最適濃度為150mg/L.

對(duì)于污染強(qiáng)度50mg/L和100mg/L的處理,接種2d后,菲基本被菌株降解;說明菌株能快速降解低濃度菲.而對(duì)于污染強(qiáng)度為 150、200、250mg/L處理, 4d內(nèi),均表現(xiàn)為污染強(qiáng)度越高、菲降解率越小,說明高濃度菲對(duì)菌株P(guān)n2降解有抑制作用;5～7d,污染強(qiáng)度對(duì)菲降解率的影響不顯著,從圖 3中可知,這是由于菲已經(jīng)被降解90%以上,菌株沒有足夠碳源菲可供利用.7d時(shí),污染強(qiáng)度為250mg/L的處理,菌株P(guān)n2對(duì)菲的降解率可達(dá) 97.01%,說明菌株 Pn2能有效地降解高濃度菲.

2.2 菌株P(guān)n2的鑒定

菌株 Pn2的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 1.所篩選出的菌株P(guān)n2為革蘭氏染色陰性,不產(chǎn)芽孢,菌體形狀為桿狀,分散排列、好氧,在1/10LB培養(yǎng)基上 28℃下培養(yǎng) 3d形成的菌落呈圓形,較大,中凹隆起,濕潤(rùn)光滑,有光澤,淡黃色.液體培養(yǎng)有絮狀沉淀,成膜能力較強(qiáng).將菌株的16S rDNA序列在 NCBI上比對(duì)分析,與Naxibactersp.有很高的同源性(100%),再結(jié)合生理生化特性的結(jié)果,可初步鑒定菌株P(guān)n2屬于納西桿菌屬.

表1 菌株P(guān)n2的生理生化特征Table11 Physiological characteristics of Pn2 strain

2.3 菌株P(guān)n2生長(zhǎng)特性

pH值、溫度、鹽濃度和通氣量對(duì)菌株P(guān)n2生長(zhǎng)的影響見圖5.25～37℃下菌株P(guān)n2能夠良好生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度為 30℃.pH6～8范圍內(nèi) Pn2可良好生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)pH值為6.鹽濃度1%～2%范圍 Pn2生長(zhǎng)良好,最適生長(zhǎng)鹽濃度為 2%.裝液量在50～150mL范圍內(nèi),菌株P(guān)n2能良好生長(zhǎng),且裝液量越少、通氣量越大,菌株生長(zhǎng)越旺盛;表明菌株P(guān)n2為好氧生長(zhǎng).

菌株P(guān)n2抗生素抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2. Pn2僅對(duì)低濃度的氨芐青霉素和氯霉素有抗性,對(duì)其余幾種抗生素?zé)o抗性.該結(jié)果為菌株抗生素標(biāo)記提供基礎(chǔ)依據(jù).

圖3 污染強(qiáng)度對(duì)菌株P(guān)n2降解菲的影響Fig.3 Effect of phenanthrene pollution stress on its degradation by strain Pn2

圖4 Pn2的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic position of strain Pn2

圖5 環(huán)境條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of environmental conditions on the growth of strain Pn2

表2 菌株P(guān)n2對(duì)抗生素的抗性Table 2 The antibiotic tolerance of strain Pn2

3 討論

以往文獻(xiàn)大量報(bào)道了植物對(duì)PAHs的吸收作用,但如何調(diào)控植物吸收積累行為、以有效地規(guī)避植物污染的風(fēng)險(xiǎn),國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道很少.近年來研究發(fā)現(xiàn),表面活性劑等可影響植物吸收 POPs.高彥征等[17]研究得出,低濃度非離子表面活性劑Tween80可促進(jìn)植物吸收PAHs,而高濃度則起抑制作用.李瀅等[18]研究發(fā)現(xiàn),Tween80濃度在CMC以上時(shí)可使小麥根中菲、芘和苯并[a]芘含量下降,卻提高了小麥莖葉中菲和芘的含量.張明等[19]發(fā)現(xiàn),水培體系中生物表面活性劑鼠李糖脂在低濃度時(shí)能促進(jìn)黑麥草根系吸收 PAHs.呂黎等[20]研究得出,陽(yáng)離子表面活性劑能使白菜、茼蒿、胡蘿卜等蔬菜體內(nèi)的菲、芘含量顯著減少,且土壤黏粒含量、作物脂肪含量越高,阻控效果越顯著.也有報(bào)道揭示溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)可影響植物吸收 POPs[21].近來,有研究表明,接種叢枝菌根真菌可調(diào)控植物對(duì)PAHs等POPs的吸收作用.施啟文等[22]研究發(fā)現(xiàn),添加菌劑可有效地促進(jìn)莖葉中低環(huán)芳烴的降解.程兆霞等[23]研究發(fā)現(xiàn),接種叢枝菌根真菌Glomus mosseae和Glomus etunicatum可促進(jìn)三葉草和辣椒對(duì)土壤中芘的吸收,并顯著提高三葉草根的芘含量、根系富集系數(shù)、根和莖葉的芘積累量.然而能否利用植物內(nèi)生細(xì)菌來調(diào)控植物對(duì)有機(jī)污染物的吸收作用,尚未有相關(guān)報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)篩選具有 PAHs降解能力的植物內(nèi)生細(xì)菌、并試圖將其定殖于植物中,有望調(diào)控植物吸收PAHs.

PAHs降解菌的環(huán)境功能及應(yīng)用已引起學(xué)者廣泛關(guān)注,但大部分功能降解菌篩選自污染土壤.周樂等[24]從土壤中篩選了一株高效降解菲的芽孢桿菌,50mg/L條件下,28℃培養(yǎng)27h,其對(duì)菲的降解率達(dá) 98.12%.毛健等[25]從污染區(qū)土壤中篩選了一株P(guān)AH降解菌,該菌經(jīng)5d培養(yǎng)后可降解89.7%的苯并[a]芘.專性功能降解菌的降解效率高,但這些從土壤中分離的功能菌能否在植物體內(nèi)定殖、并發(fā)揮降解效能,尚無文獻(xiàn)證實(shí).最近有研究者提出,從污染區(qū)植物中篩選能降解PAHs的植物內(nèi)生細(xì)菌,有望避免微生物生長(zhǎng)條件的影響,更佳地在植物體內(nèi)定殖[26-27];但是相關(guān)研究還很少.本實(shí)驗(yàn)中,從PAHs污染區(qū)植物看麥娘中篩選出了一株高效降解菲的細(xì)菌菌株P(guān)n2,經(jīng)初步鑒定,Pn2屬于納西桿菌屬,以菲為唯一碳源(49.92mg/L)、振蕩培養(yǎng)3d, Pn2對(duì)菲的降解率達(dá)98.78%.該菌降解能力高于目前其他已報(bào)道的PAHs降解細(xì)菌的降解性能,且該菌屬未曾報(bào)道過.

有關(guān)細(xì)菌降解PAHs的途徑國(guó)內(nèi)外已有大量報(bào)道.一般來說,細(xì)菌先將菲降解為中間物質(zhì) 1-羥基-2萘酸,后者進(jìn)一步的降解過程則因細(xì)菌不同而有差異,一般有鄰苯二甲酸鹽和萘代謝等兩種可能途徑[28].如假單胞菌屬(Pseudomonas)降解1- 羥基-2萘酸是通過萘代謝途徑進(jìn)行的,而氣單胞菌屬(Aeromonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligens)、芽孢桿菌(Bacillussp.)則是通過鄰苯二甲酸鹽途徑降解 1-羥基-2萘酸[28].本實(shí)驗(yàn)中納西桿菌屬降解菲的途徑尚未見報(bào)道,仍有待探索.

有關(guān)植物內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)的定殖分布已有報(bào)道.劉云霞等[29]指出,植物內(nèi)生細(xì)菌可定殖于植物的根毛、葉片、維管組織、木質(zhì)部的表皮細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、液泡等的間隙、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)中.最近,也有研究報(bào)道了 PAHs在植物體內(nèi)的微觀分布;如陳冬升等[30]研究發(fā)現(xiàn),黑麥草根亞細(xì)胞組分中菲的含量大小為細(xì)胞器＞根＞細(xì)胞壁.然而,本研究篩選所獲得的高效降解菌 Pn2能否在植物體內(nèi)良好定殖、定殖后的分布及其與植物體內(nèi)PAHs分布的關(guān)系等問題,仍有待深入探討.

4 結(jié)論

4.1 從 PAHs污染區(qū)植物看麥娘體內(nèi)分離出一株可以菲為唯一碳源生長(zhǎng)、并高效降解菲的植物內(nèi)生細(xì)菌Pn2.經(jīng)生理生化特征分析和16S rDNA序列同源性分析,初步鑒定該菌株為Naxibactersp., 該菌屬未曾見報(bào)道過.

4.2 篩選所獲得的菌株P(guān)n2對(duì)菲有良好的降解性能.Pn2能以菲為唯一碳源生長(zhǎng),菲濃度為49.92mg/L時(shí),供試條件下菲降解率高達(dá)98.78%.菌種接種量越大,菲降解率越高;隨污染強(qiáng)度升高,菲降解率先增大后減小,最適污染強(qiáng)度為150 mg/L.

4.3 菌株 Pn2有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力.溫度為25～37℃、環(huán)境pH值為6.0～8.0、鹽濃度1%～2%范圍內(nèi),菌株P(guān)n2生長(zhǎng)狀況良好.菌株P(guān)n2為好氧生長(zhǎng),通氣量越大,菌株生長(zhǎng)越旺盛.菌株P(guān)n2對(duì)低濃度的青霉素和氯霉素有抗性.

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