分光光度法測(cè)定溪黃草及其近緣種中總黃酮含量

黃冬蘭，陳小康，徐永群

（韶關(guān)學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

分光光度法測(cè)定溪黃草及其近緣種中總黃酮含量

黃冬蘭，陳小康，徐永群

（韶關(guān)學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

采用微波輔助萃取法提取溪黃草及其近緣種中的黃酮類(lèi)化合物，以蘆丁為對(duì)照品，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉作為顯色體系，用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了溪黃草及其近緣種中總黃酮的含量.該方法在0.00~1.25 mg范圍內(nèi)吸光度與含量呈良好的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率為97.43%~103.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為1.83%.結(jié)果表明：溪黃草及其近緣種中總黃酮含量差異不大.該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于溪黃草及其近緣種中總黃酮含量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為溪黃草及其近緣種的開(kāi)發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ).

溪黃草；近緣種；微波萃取；總黃酮

溪黃草為廣東民間習(xí)用草藥，常用于清熱利濕、涼血散淤、治急性黃疸肝炎、急性膽囊炎等癥，并被用作成藥消炎利膽片、膽石通膠囊及復(fù)方膽通膠囊的原料之一［1］.《中藥大辭典》記載該品來(lái)源僅為唇形科香茶屬植物線紋香茶菜Rabdosia lophanthoides的全草一種，但是目前臨床上使用的溪黃草除正品線紋香茶菜外，還有其同屬植物狹基線紋香茶菜R.Iophanthoides var.gerardianus、纖花線紋香茶菜R.Iophanthoides var.graciliflorus及溪黃草Rabdosia serra等數(shù)種近緣種植物［2］.溪黃草主要含有萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、氨基酸等活性成分［3］.其中，黃酮類(lèi)為一類(lèi)生物活性較強(qiáng)的成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗?jié)?、降血脂、抗心律失常、抑制表皮黑色素生成、防止皮膚癌等功效［4-5］.樓小紅曾對(duì)溪黃草根莖葉不同部位總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定［6］，但溪黃草及其近緣種中總黃酮含量的比較研究未見(jiàn)報(bào)道.本文作者采用微波輔助提取-分光光度法對(duì)溪黃草及其近緣種中總黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定，旨在為溪黃草及其近緣種資源的合理利用提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

1.2 儀器與試劑

儀器：722 S分光光度計(jì) （上海棱光技術(shù)有限公司）；KJ23C-AN2微波爐 （廣東美的微波爐制造有限公司）；AUY-220分析天平（島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）；878B粉碎機(jī)（江蘇省金壇市通濟(jì)儀器廠）.

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉，所用試劑均為市售分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.4 mg置于100 mL燒杯中，加適量70%乙醇溶液使之溶解，定量轉(zhuǎn)移到50.00 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液將其定容至刻度線，搖勻，即得到0.208 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.3.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取溪黃草及其近緣種粉末1.000 0 g置于聚四氟乙烯消解灌中，加入20 mL 70%的乙醇溶液，微波中火提取4 min，冷卻后過(guò)濾，收集濾液，用70%乙醇定容至50.00 mL，冷藏備用.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的選擇

選擇4因素3水平正交試驗(yàn)，考察了微波功率（中火、中高火、高火）、微波時(shí)間（4、5、6 min）、乙醇濃度（65、70、75%）和料液比（1∶10、1∶15、1∶20）比對(duì)提取率的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)微波功率為中火，微波時(shí)間為4 min，乙醇濃度為70%，料液比為1∶20時(shí)，溪黃草及其近緣種中總黃酮提取率最高，因此選擇該條件為樣品的提取條件.

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

準(zhǔn)確移取5.00 mL標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品液至25 mL比色管中，先加入1.00 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，再加入1.00 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min后，再加入10.00 mL 4%氫氧化鈉溶液，最后用70%乙醇溶液定容至25 mL，搖勻.以試劑空白作參比，采用722S可見(jiàn)分光光度計(jì)于450～570 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描.結(jié)果表明：蘆丁在510 nm處有最大吸收峰；準(zhǔn)確移取樣品溶液1.00 mL，同上操作顯色后進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)樣品在510 nm處有最大吸收峰.故選擇510 nm作為最佳測(cè)定波長(zhǎng).

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL 于 50.00 mL 比色管中， 先加入1.00 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min，再加入1.00 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min，再加入10.00 mL 10%氫氧化鈉試液，最后用70%乙醇溶液定容，搖勻.放置10 min后，以試劑空白作參比，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度.以質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.其線性方程為y=0.469 x+0.001 8，相關(guān)系數(shù)為0.999 7.表明蘆丁在0.00～1.25 mg范圍內(nèi)有較好的線性.

表1 蘆丁質(zhì)量與吸光度的關(guān)系

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 溪黃草及其近緣種中總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果

按照1.3.2所述的方法提取總黃酮制得樣品液，精密吸取樣品液1.00 mL，按照2.2所述方法顯色后測(cè)定溪黃草及其近緣種樣品提取液的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中總黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 溪黃草及其近緣種總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果（n=3）

溪黃草及其近緣種中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果表明，4種植物均含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，且四者所含的總黃酮含量差異不大.因此，民間以狹基線紋香茶菜、纖花線紋香茶菜和溪黃草作為正品溪黃草（線紋香茶菜）入藥有一定依據(jù)，至于其臨床上是否能作為正品溪黃草等同使用，仍待深入研究.

2.5 方法評(píng)價(jià)

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

在所選的測(cè)試條件下，以某一濃度的標(biāo)液為考察對(duì)象，平行測(cè)定8次進(jìn)行作儀器穩(wěn)定性考察實(shí)驗(yàn)，吸光度值分別為 0.420、0.418、0.421、0.422、0.419、0.415、0.417 和 0.423，其 RSD 值為 0.64%，表明儀器精密度良好.

2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確移取一定量的樣品溶液，按上述方法操作，測(cè)定樣品溶液在室溫下放置0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h后的吸光度，測(cè)得其RSD值為1.2%，即樣品溶液在3 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.5.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

同一份樣品，分別取樣5次，按最佳條件處理后測(cè)定，按上述操作方法測(cè)定其吸光度，測(cè)得其RSD值為2.1%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品的重復(fù)性較好，可滿足分析的要求.

2.5.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取6份已知總黃酮含量的溪黃草樣品1.000 0 g，加入一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，按照1.3.2所述的方法萃取制得樣品液，精密吸取樣品液1.00 mL，顯色后測(cè)定其吸光度，計(jì)算平均回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

采用微波輔助提取-分光光度法測(cè)定了溪黃草及其近緣種中的總黃酮的含量，該方法操作簡(jiǎn)便、精密度、穩(wěn)定性良好，為溪黃草及其近緣種中總黃酮含量測(cè)定提供了一種簡(jiǎn)便可行的方法.測(cè)定結(jié)果表明，正品溪黃草及其近緣種中總黃酮含量差異不大.因此，民間以狹基線紋香茶菜、纖花線紋香茶菜和溪黃草作為正品溪黃草（線紋香茶菜）入藥有一定依據(jù)，至于其臨床上是否能作為正品溪黃草等同使用，仍待深入研究.

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［1］肖樹(shù)雄,楊啟存,呂紅.溪黃草的來(lái)源及與混淆品的鑒別［J］.中藥材,1993,16(6):24-26.

［2］黃珊珊.中藥溪黃草四種基源植物的染色體數(shù)初報(bào)［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2011,19(4):374-376.

［3］吳劍峰.溪黃草的研究綜述［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2003,14(8):498-500.

［4］賈國(guó)惠,賈世山.甘草中黃酮的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志,1998,33(9):513-515.

［5］季宇彬,姜薇,范玉玲,等.甘草黃酮的研究進(jìn)展［J］.中草藥,2004,35(9):5-6.

［6］樓小紅.溪黃草根莖葉不同部位總黃酮的含量測(cè)定［J］.中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào),2004,19(5):316-317.

Determination of total flavones fromRabdosia lophanthoidesand its relative species by spectrophotometry

HUANG Dong-lan,CHEN Xiao-kang,XU Yong-qun
(College of Chemistry and Environmental Engineering,Shaoguan University,Shaoguan 512005,Guangdong,China)

Flavonoids were extracted from Rabdosia lophanthoides and its relative species by microwave-assisted method.Al(NO)3-NaNO2-NaOH colorimetric method was applied to determine the total flavonoids by spectrophotometry with rutin as the standard.The content of the standard was well correlated to its optical density in the range of 0.00～1.25 mg.And the addition standard recoveries were in the ranges of 97.43%～103.0%,the standard deviation (n=6)of measurement was 1.83%.The method was proved to have the advantages of simple operation,stability and good repeatability,and it would be helpful for determining the total flavonoids of Rabdosia lophanthoides and its relative species.The result provided scientific basis for exploitingRabdosia lophanthoidesand its relative species.

Rabdosia lophanthoides；relative species；microwave-assisted extraction；total flavonoids

O657.3

1007-5348（2013）08-0031-04

2013-08-12

韶關(guān)市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(201009).

黃冬蘭（1983-），女，廣東韶關(guān)人，韶關(guān)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院講師，主要從事分子光譜分析和天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用研究.

（E D.：Y， D）